新污染物分析技术：UPLC-ESI-MSMS 定量检测五种抗肿瘤药物-方法开发和验证

文摘 2024-12-02 15:00 浙江

随着癌症病例的增加，抗肿瘤药物的使用也日益增多，其在工作场所（如医院）及家庭环境中的潜在污染引发关注。目前缺乏同时定量分析环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素C、伊马替尼和5 - 氟尿嘧啶的方法，本文旨在开发并验证相关方法，具体内容如下：

1. 研究背景

- 癌症发病率上升，2050年预计全球将新增3500万病例，癌症治疗增加导致抗肿瘤药物使用增加，这些药物被NIOSH认定为有害药物，存在职业（如医护人员）和非职业（如与口服化疗药或患者排泄物接触）暴露风险，评估意外暴露对减少健康影响至关重要，擦拭采样对评估暴露有重要作用。

- 环境样本中抗肿瘤药物主要通过毛细管电泳、气相色谱或液相色谱与紫外检测器或质谱仪联用分析，近年来液相色谱 - 质谱法因其选择性和灵敏度成为分析方法基准，但现有方法无法同时灵敏定量本文研究的五种药物，在工作环境中个体可能暴露于低浓度组合药物，因此开发多药物定量方法十分必要。

2. 材料与方法

- 化合物选择与流程：基于大学医院化疗药物清单及药房信息，考虑给药途径、化合物类型、作用机制、排泄途径、半衰期、毒性、治疗方式、使用频率和平均日剂量等因素，筛选出环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素C、伊马替尼和5 - 氟尿嘧啶，开发并验证从拭子中提取和定量这些化合物的方法，优化样品采集方法以应用于实践。

- 化学试剂和材料：多种化合物及试剂来源明确，使用特定型号的聚酯拭子。

- 储备液制备：分别在甲醇中制备1mg/mL和100μg/mL的储备液，-80°C和 -20°C储存，从100μg/mL储备液制备10μg/mL工作液。

- UPLC - MS/MS分析

- 四种药物分析：使用特定色谱柱、流动相、进样量、流速和梯度洗脱程序，在正离子模式下电离，优化多种参数，确定各化合物定量离子，详细信息见表1。

- 5 - 氟尿嘧啶分析：因极性差异使用不同色谱柱、流动相、进样量、流速和梯度洗脱程序，在负离子模式下电离，相关参数及定量信息见表1。

- 提取程序：对四种药物和5 - 氟尿嘧啶分别使用含特定内标的水或水/乙腈（1/9）作为提取溶剂，旋转和超声处理后转移至进样瓶。

- 样品采集程序优化：基于已有方法，比较甲醇/水（1/1）和乙醇/水（1/1）两种溶剂，在生物安全柜内模板上进行加标实验，用不同溶剂浸湿拭子采样，比较峰面积，重复实验确定溶剂，优化采样体积为400μL。

- 方法验证：从选择性、提取效率、线性、灵敏度、精密度和准确度等方面验证方法。

本部分主要对研究中化合物的选择、方法开发、验证及适用性进行了详细阐述，并对整个研究进行了综合讨论，具体内容如下：

化合物选择

1. 初步筛选：首先建立了抗肿瘤药物清单，根据NIOSH对有害药物的定义（如致癌、致畸、遗传毒性、导致生育障碍、低剂量引起器官毒性或化学结构/毒性特征与已知有害药物相似），仅选择被NIOSH分类为有害或至少符合一项有害标准的化合物，然后筛选出可用于单药治疗的化合物，以简化后续研究中药物与效果相关性的寻找。

2. 进一步筛选：从每类药物（烷基化剂、抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂）中选择一种化合物，并额外选择一种靶向化合物（酪氨酸激酶抑制剂），最终基于给药周期最大频率、限定日剂量（DDD）和国际癌症研究机构（IARC）分类确定了环磷酰胺（烷基化，IARC 1）、丝裂霉素C（抗生素、烷基化，IARC 2B）、5 - 氟尿嘧啶（抗代谢物，IARC 3）、依托泊苷（拓扑异构酶抑制剂，IARC 1）和伊马替尼（酪氨酸激酶抑制剂，未被IARC分类）这五种化合物，它们具有不同的作用机制和IARC分类。

方法开发

1. 优化MS/MS参数：确定了各化合物的特异性质量转移，建立了最优锥电压和碰撞能量，以产生最高信号强度的离子作为定量离子。同时优化了毛细管电压、去溶剂温度、去溶剂气流和锥气流等参数，以获得最佳的信号和信噪比。例如，环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素C和伊马替尼在特定的毛细管电压、去溶剂温度、去溶剂气流和锥气流条件下，在正离子模式下电离效果最佳；5 - 氟尿嘧啶在不同的参数设置下，于负离子模式下实现最优电离。

2. 优化UPLC参数

- 四种药物分析：由于化合物药代动力学特性差异大，环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素C和伊马替尼使用特定的UPLC BEH C18色谱柱分离。进样量为5μL，以0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈为流动相A和B，采用优化的梯度洗脱程序，使部分化合物获得窄而对称的峰形，但伊马替尼存在拖尾现象，可通过在分析前注入伊马替尼标准品饱和相互作用位点来改善，同时采用双梯度洗脱程序进一步优化。

- 5 - 氟尿嘧啶分析：5 - 氟尿嘧啶极性较强，使用Cortecs HILIC色谱柱分析。经测试不同进样体积和流动相后，确定进样1μL，以10mM醋酸铵水溶液和10mM醋酸铵水/乙腈（1/9）为流动相A和B时峰形最佳。

图 3.环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素 C、伊马替尼和 5-氟尿嘧啶的色谱图。用含有 100 ng 环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素 C 和伊马替尼（拭子 1）或 100 ng 5-氟尿嘧啶（拭子 2）的混合物加标两个拭子。通过加入适当的提取溶液、振荡和超声处理来制备样品，并通过 UPLC-MS/MS 进行分析。

3. 优化提取程序：基于实验室已有方法，调整提取溶剂以匹配后续UPLC - MS/MS分析的流动相初始组成。对于环磷酰胺、依托泊苷、丝裂霉素C和伊马替尼，将提取溶剂从水/甲醇（9/1）改为水；对于5 - 氟尿嘧啶，使用水/乙腈（1/9）替代乙腈作为提取溶剂。

4. 优化样品采集程序：实验室原有方法使用1mL甲醇/水（1/1）浸湿拭子采样，经测试将溶剂体积减少至400μL（因拭子吸收量有限且该体积足以湿润采样表面），并比较了甲醇/水（1/1）和乙醇/水（1/1）浸湿拭子对测量结果的影响，发现二者无显著差异，故用乙醇替代甲醇，提高了采样安全性，使采样套件可安全用于非专业人员，同时该方法还可采集皮肤表面样本。

方法验证

1. 线性与定量限：各化合物线性校准曲线R²均超过0.99，通过多次重复分析确定了定量限（LLOQ），环磷酰胺和丝裂霉素C为0.3ng/拭子，依托泊苷为1ng/拭子，伊马替尼和5 - 氟尿嘧啶为5ng/拭子。与其他方法相比，本方法对丝裂霉素C的LLOQ更敏感，虽部分化合物LLOQ稍逊，但可同时定量四种抗肿瘤药物，具有一定优势。

2. 准确度与精密度：通过对校准样品多次重复进样计算准确度和精密度，结果表明在LLOQ处各化合物的准确度和精密度符合要求，即准确度在一定范围内与名义浓度相符，精密度偏差较小。

3. 提取效率

- 从拭子中提取：环磷酰胺、依托泊苷和丝裂霉素C在不同浓度下从拭子中的提取效率接近100%，伊马替尼和5 - 氟尿嘧啶提取效率较低，但相对标准偏差均低于10%，符合要求。

- 从表面提取：表面加标后采集拭子测试提取效率，结果显示各化合物提取效率存在差异且变异性较大，如环磷酰胺在各浓度下提取效率较好，丝裂霉素C在低浓度下提取效率较低，伊马替尼在低浓度下提取效率极低但高浓度下有所提高。化合物间提取效率差异与理化性质有关，如伊马替尼分子量大且疏水性强，易吸附于表面导致提取效率低，未来可进一步优化提取溶剂提高其从表面的提取效率。尽管部分化合物在低浓度下提取效率低，但该溶剂仍能有效提取四种药物组合。

方法适用性

在发生溢出混合物的通风橱表面不同位置（溢出中心、靠近中心、远离溢出靠近通风橱开口）采集拭子样本，结果显示远离溢出位置样本中所有化合物浓度低于LLOQ，溢出位置样本中化合物浓度可定量；清洁后再次采集相同位置样本，所有浓度均低于LLOQ，证明了该方法在实际场景中的适用性和清洁协议的有效性。

综合讨论

1. 方法特点与应用策略：开发的方法可同时定量四种抗肿瘤药物，由于化合物色谱分离特性不同，5 - 氟尿嘧啶需单独方法分析。在实际应用中，如医院环境中可能同时存在两组化合物时，需额外采集样本评估5 - 氟尿嘧啶污染；若采样区域小，需根据预期最高浓度或化合物危害性在两组化合物中选择。

2. 方法优势：本方法具有简单、安全、快速的优点，便于实际大规模应用。采用水 - 乙醇混合物浸湿拭子采样，既保证了非专业人员采样安全，又可采集皮肤表面样本；制备时间不超45分钟，可快速处理大量样本。此外，该方法包含伊马替尼，与传统方法相比，伊马替尼作为靶向药物虽预期副作用小但实际存在问题，且未被IARC评估，监测其暴露可为未来研究提供健康影响相关信息。

3. 方法灵敏度与实际意义：尽管无官方抗肿瘤药物暴露限值，但已有研究提出评估工作场所环境污染的指导值，本方法LLOQ范围为0.3 - 5ng/拭子，结合平均表面提取效率计算出可定量的表面浓度，与建议阈值对比表明该方法灵敏度足以监测暴露和评估表面污染，为采取适当措施提供依据。

Eline Verscheure, Matteo Creta, Katrien Poels, Jeroen Vanoirbeek, Manosij Ghosh, Lode Godderis,Quantification of five antineoplastic agents in swab samples using UPLC-ESI-MS/MS: Method development and validation,Analytica Chimica Acta,Volume 1336,2025,343492,ISSN 0003-2670,

https://doi.org/10.1016/j.aca.2024.343492.

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