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随着肿瘤诊疗精准化，二代测序（NGS）在治疗决策方面具有重要指导意义。但临床如何应用？选择什么检测方式？以及报告如何解读？这些都给临床医生带来困扰。今天，我们就NGS的患者选择、检测模式以及报告解读3个方面进行阐述。如上所述，NGS可用于靶点和生物标志物检测、化疗药物敏感性检测及遗传性肿瘤基因/肿瘤遗传易感性检测。广义上讲，所有肿瘤患者均可以接受基因检测；狭义上讲，根据指南推荐，不同的病种、不同的分期、出于不同的目的，不同的患者，适合做不同的基因检测。以下两种情况，可考虑跳过基因检测，直接进行靶向治疗：一些种类的癌症，可能突变类型比较单一，对于靶向药也没有可选余地，这种情况下，可以选择盲试，一旦发现没有效果，就需要另选他法。对于一些生存期不乐观癌症患者，可节省时间进行盲试，挑选概率最大的进行尝试。检测方案的选择要从患者实际患病情况出发，为患者选择最适合方案以达到精准诊断的目的。有两点选择标准：当一个疾病表型很确定时，只需要选择相对明确的直接检测。而对于一些非特异性的遗传表型，为达到更高阳性检出率必须做相对大而全的方案。先证者模式是只对家系中第一个发现该病的患者（先证者）一个人进行检测，数据分析后有疑似致病性位点，再进行父母或其他患病成员的家系Sanger测序验证。家系模式是对先证者及其父母全部进行NGS测序。家系模式会提高阳性诊断率，因其可以从遗传学上考虑见到更有意义的变异位点，如：De novo突变、纯合突变、复合杂合突变等，通过家系筛查可以判断变异致病性，有更强的遗传学证据，同时避免出现先证者模式可能造成的假阳性结果。二代测序临床报告解读肿瘤学专家组于2022年发表《肿瘤二代测序临床报告解读共识》，帮助临床医生做出正确的临床决策。共识针对以下三大要点：根据2017年AMP/ASCO/CAP联合制定的体细胞变异解读指南，体细胞变异在不同癌种中对应的药物敏感性证据分为4个等级。![]()
该体细胞变异解读指南在国内影响范围最广，许多第三方NGS检测公司的临检报告即遵循该指南的分级原则对基因变异进行解读。![]()
以上评估可以帮助我们判断，该“全阴”结果是提示“X基因野生型”可能性大，还是“X基因状态未知”可能性大。DNA测序检测融合需要同时覆盖外显子和内含子，而内含子区域常见重复区、同源区，干扰DNA-seq检测灵敏度；同时panel设计往往难以全部覆盖。基于以上情况，NCCN的NSCLC指南（2021 v1版）建议，如果使用DNA检测NGS技术没有检测到任何驱动突变时，建议补充以RNA为基础的NGS检测，以增加基因融合及MET 14外显子跳读突变的检出率。突变丰度指某个基因位点所有的等位基因中，突变的等位基因所占的相对比例，即突变型/（突变型+野生型）。拷贝数变异，是基因组上部分区域的扩增或缺失。NGS可通过对该区域的覆盖度（测序深度）来估算拷贝数变异。基于不同的样本类型，对突变丰度及拷贝数的计算存在一定差异。对于多基因变异、特别是多个潜在驱动变异共存的情况，要结合肿瘤类型、既往治疗史、相对突变丰度、既往分子检测结果等信息综合判读，以推测不同变异之间的逻辑关系（原发性vs.获得性，主克隆vs.亚克隆，敏感克隆vs.耐药克隆），指导后续治疗。对检出的胚系突变，应参照胚系突变解读流程进行注释及解读。仅有4/5级胚系变异具有相应的临床指导价值。![]()
①肿瘤突变负荷（tumor mutational burden，TMB）指肿瘤基因组编码区包含的非同义突变的数量或密度（突变数/Mb），是肿瘤新抗原负荷的替代指标。目前TMB在大量免疫治疗临床研究中证实其对疗效的预测价值。②微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）/错配修复（mismatch repair，MMR）检测对于多种实体瘤患者具有重要临床意义。对MSI的准确评估同样也建立在一定肿瘤占比的基础上。对于MSI检测结果，应综合样本肿瘤占比、TMB水平、肿瘤突变谱特征等信息综合分析，判断其可信度。③同源重组修复缺陷（HRD）通常指细胞水平上的同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）功能障碍状态，HRD可由HRR相关基因胚系突变或体细胞突变以及表观遗传失活等诸多因素导致。HRD已成为晚期卵巢癌患者临床应用PARP抑制剂的新型生物标志物，也可能对乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的PARP抑制剂和铂类药物的临床用药具有指导价值。当临床医生拿到1份NGS临检报告时，应关注其样本主要质控参数、可报告范围（检测内容）、检测方法及其局限性等相关内容，这关系到结果是否真实可信。![]()
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