甲状腺球蛋白和甲状腺球蛋白抗体检测：国际权威观点如何看

分化型甲状腺癌（DTC）是最常见的内分泌恶性肿瘤，随着时间的推移，患病率不断增加。血清甲状腺球蛋白和甲状腺球蛋白抗体测定是管理DTC患者不可或缺的一部分，新的实验室检测技术达到了出色的分析性能。反过来，新的检测方法可以显著简化临床随访方案。然而，许多因素可能会影响血清Tg和TgAb的测量，实验室人员和临床医生之间合理的双向沟通是优化甲功指标临床应用的关键。2023年8月出版的第189卷、第2期《欧洲内分泌学杂志》刊登了《甲状腺球蛋白和甲状腺球蛋白抗体：更新的临床和实验室专家共识》，分别从实验室检测和临床应用两个方面对于甲状腺球蛋白和甲状腺球蛋白抗体检测的最新进展进行了详细介绍，我们计划分两次为您介绍专家共识的核心内容，今天为您编译的是上半部分关于实验室检测的内容。

建议（更新的建议标有*，新的推荐标有**）

1.在监测DTC患者时，建议使用高灵敏度甲状腺球蛋白检测而不是传统的甲状腺球蛋白测定。B级**

2.对于DTC患者，不应通过RIA和MS方法常规测量甲状腺球蛋白。C级**

3.制造商必须按照CLSI指南评估和报告定量限（L_OQ）作为分析灵敏度的衡量标准。C级*

4.制造商应提供有关所采用方案的实验细节。B级

5.在临床实践中引入甲状腺球蛋白测定之前，应在当地验证L_OQ。C级

6.血清甲状腺球蛋白应通过根据BCR^® 457参考物质校准的经过验证的免疫测定法进行测定。A级

7.为获得最佳批间一致性，甲状腺球蛋白测定应在同一实验室中每次使用相同的测定方法进行。如果不可避免需要改变检测方法，则每位患者都需要重新测定基线水平。A级*

8.最好参加经认证的（国际）国家质量保证计划。B级*

9.是否属于高灵敏度甲状腺球蛋白检测由L_OQ值（≤0.2μg/L）定义，根据CLSI指南确定。C级*

10.临床决定水平可能与L_OQ不同，应在大型代表性患者队列中建立，并由甲状腺专科医师在他们自己的DTC患者群体中进行验证。C级**

11.检测TgAb的存在应常规进行高灵敏度甲状腺球蛋白测定。A级

12.建议使用针对第一个IRP 65/93进行标准化的经过验证的定量TgAb免疫测定。C级

13.在DTC患者中，高于L_OQ的TgAb值可能会干扰甲状腺球蛋白测定结果。C级*

14.实验室应验证制造商提供的L_OD、L_OQ和参考区间。C级

15.实验室应报告TgAb的两个参考区间：一个基于无甲状腺疾病人群中的TgAb，应用于自身免疫性甲状腺疾病的诊断，以及L_OQ，应用作为DTC患者的正常上限。C级

16.为了临床诊疗处置的前后一致性，TgAb浓度的连续测定应在同一实验室中每次使用相同的测定方法进行。B级

17.用于检测TgAb干扰的常规检测方法对于预测高灵敏度甲状腺球蛋白检测的干扰不够准确。D级

18.目前，尚无既能为临床使用甲状腺球蛋白测定提供足够的准确性，又有足够灵敏度的克服TgAb干扰的方法。是否仍然需要这样的替代方案是值得商榷的。C级

19.对于检测不到高灵敏度甲状腺球蛋白的TgAb阳性患者，不鼓励常规额外使用甲状腺球蛋白MS、甲状腺球蛋白RIA，应仅在选定的个体病例中考虑。C级**

20.不建议对HAb进行常规筛查。C级*

21.如果临床怀疑HAb干扰，可以使用专门的市售HAb阻断剂确认是否存在HAb。甲状腺球蛋白水平降低≥20%被认为对HAb呈阳性;然而，这种测得的Tg水平并不是可靠的定量测量，不应报告给临床医生。同时，阻断试剂可能并非在所有情况下都有效，在这些情况下，应考虑使用不同的测定方法测量Tg或进行连续血清稀释或PEG沉淀。C级*

22.在确认HAb干扰的情况下，相关检测不能认为Tg浓度是可靠的。C级**

23.排除高剂量钩状效应的浓度应由制造商确定并由当地临床实验室验证。B级**

24.如果临床怀疑钩状效应，应在报告甲状腺球蛋白浓度之前进行血清或清除稀释。B级**

25.在怀疑生物素干扰的情况下，建议在停止摄入生物素72小时或更长时间后采样。或除此之外，应考虑连续稀释检测、通过链霉亲和素包被的磁珠去除多余的生物素，或与另一种不基于生物素-链霉亲和素结合的方法进行比较，例如采用其他抗原-抗体结合位点的免疫学检测方法、质谱或放射免疫测定。C级**

26.当使用基于链霉亲和素-生物素结合方法的甲状腺球蛋白测定时，应定期询问患者是否摄入含有生物素的膳食补充剂，并建议在采样前72小时停用生物素。C级**

27.在存在生物素干扰的情况下，使用基于链霉亲和素-生物素的测定方法进行高灵敏度甲状腺球蛋白检测不能被认为是可靠的。C级**

甲状腺球蛋白水平最初是通过竞争性放射免疫法（RIA）测量的，由于灵敏度更高且便于实现自动化，目前已广泛被免疫测定（IMA）取代。许多市售Tg-IMA能够检测和定量极低的Tg浓度（约0.1μg/L），被称为hsTg-IMA或第二代Tg-IMA。在hsTg检测可用之前，只有在甲状腺激素阻断（THW）或重组人TSH（rhTSH）刺激后才能达到对Tg的最高诊断灵敏度。使用hsTg检测在很大程度上消除了对DTC随访的常规TSH刺激的需要。最近，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）Tg测定（Tg-MS）开始应用。它们基于胰蛋白酶消化、免疫捕获和Tg特异性肽的定量。这消除了TgAb和嗜异性抗体（HAb）对检测本身的干扰，当然不能消除生物“体内”干扰。遗憾的是，Tg-MS检测尚未标准化和验证，目前未能在TgAb阳性患者中显示出优于hsTg的临床灵敏度。

在测定甲状腺癌患者的血清Tg水平时，需要考虑几个分析性能方面的问题。

功能灵敏度（FS）是作为检测能力的衡量标准引入的，最初被描述用于评估TSH测定的灵敏度，后来被用于Tg测定。美国国家临床生物化学学会（NACB）FS指南方案建议，通过与患者血清样本相同的方式，在可报告范围内、在两个不同批次的试剂和校准品上以及6个月内测量TgAb阴性患者的样本来确定精密度。目标是确定对应于CV 20%作为FS的Tg浓度。这种方法可能被认为是更具临床相关性的检测性能评估，因为FS较好地反映了临床实践中Tg在参考区间范围内用于监测DTC患者的能力。目前的NACB指南“事实上”没有被制造商用于定义其Tg分析的FS，因为按照NACB指南测定FS较为费时费力。检测限（L_OD）和定量限（L_OQ）也是确定制造商和临床实验室常用的检测系统在低浓度时分析性能的常用方法。检测限（L_OD）是与空白限区分开来的最低分析物浓度。定量限（L_OQ）是在总允许误差的范围内，能被准确测量的最低分析物浓度。总允许误差表示分析质量要求，它为单次测量或单次测试结果中可接受的不精密度（随机误差）和偏倚（系统误差）设置限值。对于Tg，欧洲临床化学和检验医学联合会提出的理想总允许误差为29.8%，最大承认值为44.8%。为了使用总误差准确度确定L_OQ，至少需要使用两个试剂批次、一个仪器系统、3天、至少4个独立的低浓度样品、每天3次重复，每个试剂批次至少总共36个低浓度样品重复（3天×4个独立的低浓度样品×3个重复）。对于每个试剂批次和每个测量结果，将偏差与观察到的标准偏差相结合，得出总误差。L_OQ对应于总误差满足准确度目标的样本浓度。值得注意的是，这里的描述是基于最低可接受目标的实验设计要求。增加某些浓度水平和/或增加重复检测次数，以提高所得L_OQ估计值的可靠性可能是合适的。L_OQ因未能监测试剂批次间随时间的变化而受到限制，并且可能使用添加Tg的人工基质，而不是含有天然Tg的人血清。因此，任何参与对其DTC患者进行长期Tg测量的实验室都应该能够初步验证制造商确定的L_OQ，并尽可能随着时间的推移建立方法的FS。在日常实验室实践中，我们的小组建议采用L_OQ来定义Tg的最低检测限和定量限。临床实验室还应在其内部评估过程中验证制造商的L_OQ声明。

甲状腺球蛋白是一种分子量大的、异质的碘化糖蛋白，不同的抗体用于不同的检测。因此，不同的检测方法将得出不同的甲状腺球蛋白浓度。有证标准物质（CRM457），现在称为BCR^® 457（欧盟委员会，标准物质和方法研究所）的引入将方法间变异从40%-60%降低到约30%。然而，不同的检测方法间仍然存在显著的差异，改变Tg检测方法学可能会影响其连续测定的临床诊断价值。因此，在随访期间应保持相同的Tg测定方法，并尽可能在相同的实验室检测。如果检测方法的变化是不可避免的，建议通过两种方法平行检测来重新确定基线水平。同样，检测中捕获抗体和信号抗体的连续性对于保证检测结果的纵向可比性是必要的;这里发生任何变化也都需要重新确定患者的Tg基线水平。

“高度敏感”Tg检测的合理临床标准应该是根据hsTg检测的结果，在DTC随访期间避免常规TSH刺激测试。许多研究证明，未刺激的hsTg水平≤0.2g/L 能够免除超过95%的DTC患者对TSH刺激的需求。此外，目前推荐未刺激的hsTg值≤0.2μg/L，以确定动态风险分层系统中对治疗的良好反应。此外，将L_OQ≤0.2μg/L的Tg IMA定义为“高度敏感”似乎是合理的。需要指出的是，分析灵敏度是一个技术参数，而医学决定水平应在大型临床队列中得出，并且可能与分析灵敏度不同。尽管如此，与传统检测方法相比，更高的分析灵敏度不仅可以检测较低浓度的Tg，还可以提供更窄的误差范围，从而在较低的浓度水平上具有更好的重现性。

就像传统检测方法一样，hsTg IMA可能会受到TgAb和HAb或生物素等外源性物质的干扰。然而，特别是对于TgAb，它们对临床实践的影响（如本共识进一步详述的）在hsTg检测中可能不那么严重。

高达25%的DTC患者在诊断时TgAb检测呈阳性。当然，临床实践中的诊断时间是可变的，因为在一些国家，多达一半的DTC是通过组织病理而不是术前诊断的。因此，预计TgAb检测阳性的概率在外科手术后会发生变化，这可能导致文献中报道的不同阳性率。无论如何，TgAb的存在可能导致广泛使用的Tg-IMA中Tg浓度降低或检测不到。值得注意的是，即使通常认为TgAb浓度越高，对Tg浓度的干扰就越强（反之亦然），低浓度的TgAb也可能会掩盖通过hsTg检测到的极低Tg浓度。有两种方法可以检测TgAb干扰：测定Tg的回收率或直接测量抗体，尽管较新的hsTg检测似乎比老一代检测更能抵抗TgAb的影响。此外，正如进一步详述的那样，与传统的方法相比，使用高灵敏度测定方法可以对Tg进行可靠的定性评估（见下文）。

回收实验的一个可能优势是区分升高的TgAb是否会导致“体外”干扰，或者这些是否与IMA 测量无关。在常规Tg回收率测定中，当使用含有40-50μg/L Tg的血清缓冲液时，回收率>70%-80%被认为是可以接受的。然而，只能检测到强干扰使得它们不足以发现与临床相关的Tg低浓度（即≤1μg/L）的干扰。近年来，通过添加低浓度（即1-5μg/L）Tg的血清进行Tg“小回收”试验。然而，最近发表的对1120份血清样本的研究报告称，对大多数患者进行甲状腺球蛋白“小回收”没有获得比TgAb免疫测定额外的临床益处。此外，在TgAb 存在阳性但对回收实验没有影响的患者中，不能排除TgAb结合的Tg的生物清除更快，导致甲状腺球蛋白的血液浓度降低。

最初，TgAb免疫测定方法是为自身免疫性甲状腺疾病的诊断评估而开发的。不过，TgAb检测表现出不同的敏感性，并且在测定的抗体的绝对水平方面也有所不同。因此，当使用制造商的参考区间时，低浓度的TgAb仍然被认为是“正常”的，可能已经对Tg测定造成了重大干扰。值得注意的是，DTC患者TgAb的测定有助于排除对Tg检测的潜在干扰，并使用检测特异性LOD或LOQ，因为临界值可能更适合检测DTC患者的TgAb分析干扰。使用较低的TgAb检测限将提供更高的确定性，即测得的TgAb浓度确实代表了个体患者的潜在相关干扰源。因此，虽然鼓励制造商评估并提供TgAb检测的LOD和LOQ，但这些数据不应替代本地评估。一些学者主张从临床数据中获得更高的TgAb阈值，以减少假阳性结果。重要的是，由于Tg和TgAb的异质性，没有单一的测定可以确定地预测给定样品中的TgAb是否会干扰Tg检测。被归类为TgAb阳性的样本百分比在检测之间差异很大。此外，尽管大多数TgAb检测声称已根据第一个国际参考物质（IRP）65/93标准进行了标准化，但观察到广泛的批间变异性，相关系数为0.25至0.82。因此，在某些情况下，建议使用不止一种TgAb检测方法。最后，应使用相同的检测方法纵向测量TgAb浓度，当无法避免检测方法更改时，建议单独重新确定TgAb值的基线。当TgAb浓度用作替代肿瘤标志物时，这一点尤其重要（见下文）。

一些学者声称甲状腺球蛋白-RIAs对TgAb干扰具有更好的抗干扰性能。然而，这些数据受到了其他人的质疑。事实上，一些实验室已经在TgAb阳性患者中采用了RIA或LC-MS/MS。通常采用反射策略，并通过IMA测量TgAb阴性样本中的Tg;或RIA或LC-MS/MS或TgAb 阳性样本的小回收检测。然而，Tg RIA尚未广泛使用，在大多数检测中，分析灵敏度对于临床使用来说并不理想。同样，目前在器质性疾病和Tg在0.1至0.5μg/L之间的患者中，Tg-MS产生的假阴性结果比例不可忽略。最后，对大多数患者进行常规Tg小回收没有获得比TgAb IMA检测额外的临床益处。此外，由于加速清除Tg-TgAb复合物而导致的低Tg值无法通过这些方法发现。因此，L_OQ≤0.2μg/L的Tg IMA 仍然是TgAb阴性患者的主要检测方法，而TgAb阳性患者应主要使用TgAb水平作为替代肿瘤标志物进行监测。反之亦然，Tg-MS、Tg-RIA或Tg小回收应仅在选定的个体病例（即生化检测结果和临床表现不一致）中考虑（如果可用）。还应该注意的是，最近在检测不到hsTg（即<0.2 ug/L）的TgAb阳性患者中报道了器质性疾病，尤其是远处转移的风险较低。因此，正如本文进一步详述的那样，现在似乎有可能使用hsTg检测准确跟踪TgAb阳性患者。

由于HAb的存在，大约1%的患者表现出对Tg测量的干扰。这些抗体可以结合异种抗原并在捕获抗体和检测抗体之间形成桥梁，导致Tg-IMA中的Tg测量值假性升高（或罕见地假性降低）。HAb干扰的存在可以通过各种方法进行评估，例如：

（1）使用市售的嗜异性抗体封闭试剂进行样品处理;

（2）由于缺乏线性，样品的连续稀释会怀疑有干扰;

（3）使用不同的IMA或替代方法进行测试;

（4）聚乙二醇沉淀（PEG）去除HAb;

（5）Tg-MS分析。使用多种策略来评估HAb干扰是最有效的方法。评估HAb干扰不是常规做法，在Tg值和临床表现不一致的情况下，应进行评估。

由于大量抗原过量耗尽了捕获抗体的结合能力，导致分析物浓度非常高的血清中血清分析物值不适当正常或降低，因此IMA会受到钩状效应的影响。排除钩状效应的浓度应由制造商确定并在当地验证。目前可用的Tg检测试剂盒可以很好地避免钩状效应，但偶尔可能发生在肿瘤负荷较高的癌症转移患者（即Tg >1000 μg/L）和在细针穿刺样本中测量Tg时。血清或冲洗稀释液（通常为1：10体积/体积）或回收实验可用于检测可疑病例的钩状效应。

影响某些Tg和TgAb检测结果的另一个新出现的实验室问题是生物素的干扰。生物素（或维生素H）是一种水溶性维生素，由肠道中的细菌合成，天然存在于谷物、猪肉和鸡蛋等食物中。每日足够的生物素摄入量为30μg，很容易从正常饮食中获得。由于与亲和素及其衍生物具有很强的非共价结合相互作用，生物素在当前的免疫测定中被广泛用于将抗原-抗体复合物捕获到固相中。在生理血浆浓度（0.3-0.7 ng/mL）中，生物素不会影响免疫测定。相反，生物素（高达20毫克/天）用于化妆品的普及以及最近涉及非常高剂量的生物素（高达 300毫克/天）治疗进行性多发性硬化症的临床试验表明，生物素干扰免疫测定的影响更广泛，存在误诊和/或不适当医疗干预的风险。干扰的大小和与干扰相关的生物素浓度阈值取决于分析物和检测方法（如竞争性或直接测定，一步法或两步法形式）。检测试剂盒制造商提供了上述生物素临界值和自摄入以来可能发生干扰的时间范围（从8到72小时，具体取决于生物素的剂量/天和治疗的持续时间）。制造商正在生产“保护”免受生物素干扰的IMA，并且已经提供了一些重新调整的分析方法。如果怀疑生物素干扰，建议在患者禁戒生物素一段时间后采样。如果无法进行样品回收且需要确认生物素干扰，应考虑进行连续稀释试验，通过链霉亲和素包被的磁珠去除多余的生物素，或与其他非基于生物素-链霉亲和素结合的方法进行比较。