赵锐，狄靖宜，张广通，刘浩，高伟霞
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0541
近日，《生物技术通报》在线发表了题为《基于转录组学挖掘兽疫链球菌内源表达元件及高产透明质酸应用》的研究报告。本研究基于兽疫链球菌ATCC39920的转录组数据，通过启动子预测等手段，筛选了在不同培养条件下差异化表达的PR元件，并利用较强的PR元件来增强透明质酸合成相关基因hasA, hasB, hasC, hasD, hasE的表达。旨在建立多样化的内源性表达元件文库，以期为兽疫链球菌的代谢改造提供多种可供选择的工具，并为外源蛋白在兽疫链球菌中的高效稳定表达奠定基础。
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兽疫链球菌自身可高产较高分子量HA，已被广泛用于HA生产。相较于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等常见模式微生物，兽疫链球菌缺乏高效表达元件，这为其代谢改造带来了极大困难。当前，关于兽疫链球菌中内源表达元件筛选的研究相对较少，在代谢改造中常依赖于异源表达系统。然而，这些外源系统在实际应用中面临多种困难。外源表达系统难以被直接应用于兽疫链球菌代谢改造当中。此外，尽管链霉菌来源的启动子cp25能够在兽疫链球菌中正常表达，但其表达强度远无法达到预期水平，在实际应用中价值十分有限。因此，本研究通过分析转录组测序结果，结合启动子预测网站，构建了兽疫链球菌内源性的表达元件文库，并对各表达元件的强度进行表征，通过绿色荧光蛋白GFP的发光显色及转录水平来探究启动子与其自身RBS的强度。我们发现，部分表达元件在不同的培养基中和（或）菌株生长的不同阶段转录水平具有较大差异，这可能是由于启动子自身存在的反馈抑制/激活机制，导致转录水平发生较大程度的改变。
筛选得到的强表达元件能够应用于强化代谢途径以及提高蛋白表达效果。其中，利用含有强组成型启动子的表达元件，有助于实现目的基因的持续高效表达。由于代谢改造中，某些蛋白的过量表达可能对菌株生长繁殖产生不利影响，影响蛋白表达及产物积累。利用挖掘到的指数期表达低、稳定期高效的PR元件（如PR22、PR23），可减轻过度表达对菌株生长的压力，提高代谢改造成功率，实现目的蛋白的稳定高效表达和目标产物的持续积累。此外，实验筛选得到的弱表达元件（如PR3、PR4、PR20）适用于减弱特定代谢途径的竞争作用，减少对HA合成的干扰。细胞壁与HA具有共同的前体物质UDP-N-乙酰氨基葡萄糖，通过弱化细胞壁合成途径能够有效降低二者的竞争，提高HA产量。而疏松的细胞壁结构还能够促进透明质酸的分泌，进一步提高HA的产量。需注意的是，荧光强度与转录水平之间并未呈现出严格的正相关性，这主要归因于不同表达元件所具有的RBS序列差异，影响了核糖体结合的紧密程度以及蛋白质翻译效率。
随后，在野生型兽疫链球菌当中利用筛选得到的强表达元件PR31分别过表达了HA合成的五个基因hasA, hasB, hasC, hasD, hasE，根据发酵数据可知hasA、hasD的过表达对HA的产量的提高具有积极作用。由此可见，上述内源表达元件将为改造兽疫链球菌代谢改造以及外源蛋白高效表达提供重要帮助。
本研究从兽疫链球菌出发，通过表征绿色荧光蛋白成功筛选得到32个不同强度的内源性表达元件，并以强表达元件PR31为基础实现兽疫链球菌透明质酸合成酶编码基因hasA, hasB, hasC, hasD, hasE的高效表达。在2 L发酵罐内，过表达hasA，hasD基因使得HA终产量分别达到5.654 g/L以及5.283 g/L，相较于野生型兽疫链球菌分别提高了43％以及31％，验证了这些表达元件的实用性。
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