基于R-loop靶向编辑技术的R-loop功能位点高通量筛选系统
皮一飞，宋新辉，王淅琳，李谨谨，孙长斌，徐炜
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0613
R-loop是一种在原核和真核生物中普遍存在的特殊结构，与癌症密切相关。异常R-loop的形成可能导致基因组不稳定，从而促进癌症的发生和发展。此外，R-loop通过影响基因的表达来调控细胞增殖、凋亡等关键过程，在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。
肿瘤细胞耐药性是肿瘤治疗的主要挑战之一。目前的研究主要集中在利用二代测序和单细胞转录组测序研究细胞基因表达对药物的响应，以及利用CRISPR/Cas9筛选重要的原癌基因。然而，R-loop在肿瘤细胞耐药性中的具体作用尚未充分探索。现有的R-loop研究普遍采用全基因组范围内的大规模编辑策略，虽然能揭示R-loop的全局分布和动态变化趋势，但难以准确解析单个R-loop位点在特定生物学过程中的具体功能。
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本文主要包括以下几部分内容：
2.1 构建哺乳动物细胞R-loop靶向编辑技术
2.2 R-loop功能位点高通量筛选技术的开发
2.3 筛选与HeLa细胞耐药性相关的R-loop位点
2.4 候选基因的验证
3 讨论
3.1 R-loop功能位点相关基因在HeLa细胞耐药性中的作用解析
3.2 通路富集分析揭示R-loop功能位点与肿瘤细胞耐药性间的潜在联系
3.3 抗肿瘤药物处理下基因通路变化与耐药性共性影响的探讨
3.4 R-loop靶向编辑技术的应用前景与研究展望
顺铂处理耐药组R-loop功能位点中ZBTB20是一种转录因子，其功能涉及基因表达调控、细胞增殖与分化，与肿瘤细胞耐药性的形成存在关联。TMEM176A编码一种跨膜蛋白，调节细胞内离子稳态，影响细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力，这些过程均与肿瘤细胞耐药性相关。
顺铂处理药物敏感组R-loop功能位点中CCDC71、CCDC30、CCDC179和CCDC157参与跨膜信号传导，影响肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等过程。TXNRD1编码一种抗氧化酶，可能通过减少氧化应激对肿瘤细胞的损伤，促进其生存和耐药性。TPP2编码一种溶酶体内的丝氨酸蛋白酶，参与氨基酸代谢和细胞内稳态等多种生理过程。在某些癌症中，TPP2可能通过调节细胞凋亡、自噬及氧化应激响应等机制，影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
紫杉醇处理耐药组R-loop功能位点中ACTRT1编码的蛋白属于ARP家族，可能通过影响细胞骨架动态、细胞周期进程或信号转导，间接参与肿瘤耐药性的调控。ZYG11A编码一种泛素连接酶E3复合体的组件，可能通过调节细胞周期检查点、DNA损伤修复或凋亡通路，影响肿瘤细胞对治疗的响应。
紫杉醇处理药物敏感组R-loop功能位点中CCM2是CCMs蛋白复合体的组成部分，可能通过调节细胞黏附、迁移、血管生成或信号转导通路，影响肿瘤细胞对治疗的响应。CCL22编码一种趋化因子，通过招募免疫抑制性细胞或改变免疫细胞功能，影响抗肿瘤免疫应答和免疫治疗的耐药性。
3.2 通路富集分析揭示R-loop功能位点与肿瘤细胞耐药性间的潜在联系
泛素化系统在肿瘤细胞耐药性过程中扮演重要角色，异常的泛素化/去泛素化过程可能导致关键蛋白如药物靶蛋白、药物代谢酶、药物转运蛋白等的稳定性改变，从而影响药物的疗效和耐药性。
转录因子，如DNA结合转录抑制剂活性和RNAP II特异性等，可能调控与药物敏感性、耐药性相关基因的表达。异常的转录抑制活性可能导致耐药相关基因的表达上调或下调，从而改变细胞对药物的敏感性。
通路分析进一步揭示了R-loop功能位点关联基因参与DNA/RNA代谢、细胞骨架、神经发育、信号转导、代谢调控等多个生物学过程。这些过程通过调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡、自噬等关键环节，对肿瘤细胞对抗药物的反应性产生影响。此外，mTOR、TORC2复合物、ADP代谢等通路也涉及细胞周期、DNA损伤修复、免疫反应、细胞黏附、凋亡等生物过程，通过调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡、自噬以及免疫逃逸等核心功能，影响肿瘤细胞对药物的响应性。
3.3 抗肿瘤药物处理下基因通路变化与耐药性共性影响的探讨
顺铂和紫杉醇处理组26个关联同一基因的耐药性相关R-loop功能位点，参与转录调控、细胞骨架与迁移、氧化还原与代谢、信号转导与激酶活动、细胞外基质与黏附作用、膜转运与药物代谢、蛋白质修饰与折叠等多个生物学过程，提示这些多元化通路可能构成了跨越不同药物类型的共性耐药机制核心。此外，两种药物在8个R-loop功能位点上表现出相同的药物敏感性特征，涉及的基因包括锌指转录因子、肿瘤抑制因子及其同源物、Wnt信号通路相关基因、E3泛素连接酶等，暗示着维持或强化它们的正常功能可能是增强肿瘤细胞对治疗药物敏感性的关键途径。
因此，这些共性基因可能作为关键节点，通过调节相关信号通路或生物过程，影响肿瘤细胞对药物的响应性。深入研究这些共性耐药和敏感基因的功能属性、在药物处理条件下的表达动态变化，以及它们与其他分子之间的相互作用网络，将有助于我们从系统层面解析肿瘤细胞耐药性的分子基础。
3.4 R-loop靶向编辑技术的应用前景与研究展望
基于R-loop靶向编辑技术，首次系统检测了R-loop位点对肿瘤药物敏感性的影响，鉴定出肿瘤细胞对药物敏感相关的R-loop位点，这些位点的鉴定为进一步了解肿瘤细胞耐药性机理提供了研究方向。在此基础上，可以深入探索R-loop变化对基因调控区域的状态产生怎样的影响，揭示R-loop影响肿瘤细胞药物敏感的分子机理，促进R-loop生物学在肿瘤靶向治疗中的应用。
本研究通过构建dCas9-RNaseH1表达载体，建立了适用于哺乳动物细胞的R-loop靶向编辑系统，并在此基础上开发了全基因组R-loop功能位点高通量筛选技术。应用该技术，筛选出了744个对HeLa细胞耐药性具有关键调控作用的R-loop功能位点，为R-loop影响肿瘤药物耐药性研究提供了一种高效的技术工具。
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