文静，李倩倩，张明达，谭茗月，金博阳，沈秀丽，杜志强
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0540
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）俗称小龙虾，是我国一种重要的水产养殖品种。金黄色葡萄球菌侵袭克氏原螯虾之后，虾体内生成肠毒素，长期存留在虾体内，食用过程中，加工方法不当致使肠毒素随着食物进入人体，就会造成食物中毒。避免克氏原螯虾食用产品中细菌的过量残留，需要从克氏原螯虾自身对细菌的抵抗力方面进行强化，从而保持克氏原螯虾养殖行业以及食品加工行业的健康有序发展。
近日，《生物技术通报》在线发表了题为《Duox 2调控克氏原螯虾肠组织抗细菌先天免疫的分子机制》的研究报告。本文重点研究面对金黄色葡萄球菌侵染，克氏原螯虾DUOX 2通过调控ROS的产生从而影响肠道先天免疫反应的分子机理，尤其是抗菌肽的表达调控。
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双氧化酶（DUOXs）在哺乳动物和甲壳类动物多种组织中分布。在感染副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）或脂多糖（LPS）6 h之后，拟穴青蟹Duox基因在血细胞和肝胰腺中表达量发生上调，这表明Duox 2参与到了细菌感染的免疫反应，尤其是在感染的第一阶段。本论文的研究结果与前人结论相一致，Duox 2在克氏原螯虾血细胞、肝胰腺、肠、鳃组织中均有表达，并且在金黄色葡萄球菌刺激后，Duox 2表达水平呈明显上升趋势，并且集中在细菌刺激之后的2-36 h时间段。
相关研究结果证实Duox基因在肠道中有特异性表达的现象，揭示了其可以调节宿主肠道免疫功能的可能性。本研究中，与dsGFP+金黄色葡萄球菌刺激组相比较，dsDuox 2+金黄色葡萄球菌刺激组克氏原螯虾的存活率显著降低，并且细菌清除效果也明显下降。因为细菌可以随着克氏原螯虾血淋巴的循环分布在全身各处，细菌刺激后克氏原螯虾血淋巴中细菌增殖的数量上升，降低Duox 2基因的表达量之后，导致了克氏原螯虾的加速死亡，说明Duox 2基因影响克氏原螯虾对抗细菌侵染的免疫反应过程。
ROS包括超氧阴离子和过氧化氢，有研究表明低水平的ROS有助于宿主对抗病原微生物入侵，因此，ROS的产生以及浓度的监管对于宿主氧化还原稳态的维持十分重要。ROS具有调节细胞凋亡的功能，有助于宿主积极发挥免疫防御作用。在宿主免疫防御中，细胞因炎症反应产生ROS对革兰氏阳性等病原菌均具有高度抵抗作用。本研究检测了注射Duox 2双链RNA与金黄色葡萄球菌之后，克氏原螯虾肠组织ROS水平的变化情况，结果显示，ROS的水平仍然是呈上升趋势，但是与GFP对照组相比较，实验组的上升趋势是明显被抑制的。以上的结果表明，ROS确实在对抗金黄色葡萄球菌侵染的过程发挥了免疫作用；然而，在人为降低Duox 2基因表达量之后，在金黄色葡萄球菌刺激的情况下，ROS上升的水平会被明显受到抑制，从而削弱了宿主对于病原的清除能力，最终导致了克氏原螯虾的加速死亡。
肠组织作为重要的消化部位，也是重要的免疫器官，它既可以产生ROS来防御病原，也可以产生抗菌肽（AMPs）来对细菌进行清除。在甲壳类动物中，AMPs可以由Toll和IMD信号途径协同激活而产生。目前，已经在日本囊对虾、凡纳滨对虾、克氏原螯虾中鉴定出Toll受体。而且，发现在金黄色葡萄球菌刺激12 h后克氏原螯虾肠组织toll基因表达量会被明显上调，说明Toll信号途径在克氏原螯虾防御金黄色葡萄球菌侵染过程具有积极作用。本研究中，RNAi实验过程金黄色葡萄球菌刺激克氏原螯虾后，实验组中toll 1、toll 3基因的表达水平与对照组相比，上升水平明显受到抑制。作为抗菌肽的一种，抗脂多糖因子（ALF）已在多种甲壳类动物中被鉴定。在本研究中，RNAi实验过程金黄色葡萄球菌刺激克氏原螯虾之后，GFP双链RNA+金黄色葡萄球菌刺激组中ALF 1基因的表达显著上调，但是，人为降低Duox 2表达量之后，ALF 1基因的表达水平被明显抑制。此外，溶菌酶是一种重要的免疫效应蛋白，可以促进消化道消化活动以及具有免疫信号调节作用，可以作为抗微生物剂来调节肠道免疫。本研究中，dsGFP+金黄色葡萄球菌刺激组的lysozyme基因的表达量显著上调，而dsDuox 2+金黄色葡萄球菌刺激组lysozyme基因的表达量受到明显抑制。综上所述，实验组dsDuox 2+金黄色葡萄球菌刺激组中先天免疫相关AMPs基因的表达水平均受到显著抑制，即克氏原螯虾Duox 2基因对Toll信号通路具有一定的调控作用，从而影响了抗菌肽效应基因的表达量。
Duox 2通过调节克氏原螯虾肠组织ROS水平来影响Toll信号通路，进而调节抗菌肽效应基因的表达，最终影响机体对细菌的清除能力。
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