单链DNA退火蛋白介导细菌基因组同源重组的机制及应用研究进展
尹号，尤留超，韩瑞，高鹏程，付磊，储岳峰
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0457
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1 同源重组
2 单链 DNA 退火蛋白/核酸外切酶双组分重组酶
2.1 单链DNA退火蛋白
3 单链退火蛋白介导的同源重组机制模型
4 单链DNA退火蛋白介导的同源重组应用策略
4.1 基因编辑技术开发
4.2 细菌工程应用
5 总结与展望
SSAP介导的同源重组工程的工作效率相较于一般细菌的内源性RecA介导的同源重组已经有了质的飞跃，但为了能够适应现在重组工程迅速发展带来的需求，其重组效率仍需要进一步提升。目前来看，效果较明显的提升策略有：（1）设计靶向复制叉滞后链的寡核苷酸，并在设计过程中避免其形成稳定的二级结构，从而保障SSAP-DNA复合物能更有效的退火到靶点处；（2）对寡核苷酸的5'端进行硫代磷酸化修饰，增强其对菌体自身核酸酶消化的抵抗能力，从而保障DNA重组的底物量；（3）直接删除目的菌种中以外源DNA为靶标的核酸酶基因，以减少对重组底物的消耗，从而增加重组的频率。值得关注的是，针对于SSAP介导的同源重组过程中反复提到了滞后链和前导链，但在实际应用情况中，要确定特定细菌的复制起点及复制终止位点是一个难题，所以可能需要更有效的方法来帮助确定滞后链和前导链情况，才能有效的应用这些策略。
随着合成生物学的出现与发展，为理解各种生物学的基本原理，开发新型医学应用工具，找到一种合适的生物来作为“底盘”展开研究是必要的。拥有天然缩减基因组的支原体恰恰符合这一底盘的概念，故被选做了合成生物学项目的重要候选。目前已有学者通过单链DNA退火蛋白GP35介导的ssDNA同源重组过程，完成了对肺炎支原体和鸡毒支原体的基因组编辑。其选用的方式是将GP35的基因序列通过转座子方式整合到细菌基因组，由于不像质粒一样存在显著的拷贝数差异，基因组进行表达的效果将更加均匀，从而获得更稳定的编辑效果，这种修饰方式同样适用于各种生产工程中的菌株。但针对一些重要的致病菌的疫苗开发工程，往往倾向于通过无痕缺失的方式来完成对毒力基因的编辑，如何在细菌中建立高效的SSAP介导的同源重组系统并且没有任何痕迹的残留显得尤为重要。
合适的SSB蛋白对SSAP的重组效率的提升已被证实，此外，λRed系统中的Gam发挥着清除核酸酶的作用，在Photorhabdus luminescens中也有筛选到Gam的同源物Plu2934，那么在其他细菌中是否也能筛选到Gam的同源物，并找到合适的SSB蛋白，从而构建全面、高效的同源重组系统，还有待进一步研究。
目前通过对重组产物的分析以及对噬菌体的研究深入，SSAP介导的同源重组机制逐渐揭开了面纱，但是有关：（1）在SSAP介导的同源重组途径中，SSAP与其对应的核酸外切酶的相互作用的必要性以及特异性；（2）核酸外切酶究竟如何将外源dsDNA处理成ssDNA的；（3）SSAP-DNA复合物究竟是以何种方式找到基因组复制过程的复制叉的，是否存在有向导的物质；以及（4）SSAP介导的同源重组过程是否有解旋酶的参与，仍需要进一步研究。这将帮助我们了解噬菌体感染过程中发生的重要重组过程，更是帮助我们找准方向，进一步优化SSAP介导的同源重组工程。从而利用噬菌体源SSAP蛋白开发出更多细菌的基因组编辑方法，为缺乏基因组编辑方法的细菌提供技术参照，期待为更多细菌在基因功能、致病机制以及工程菌株开发等方面发挥更重要的作用。
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