李蕊蕊，那道远，王洪林，赵亮，谭文松，叶倩
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0547
随着载体递送、基因编辑等分子生物学技术的快速发展，基因治疗正在革新人类疾病的治疗方式，并在罕见遗传病领域展现出巨大应用潜力。截至2024年，已有超过200项临床试验选择重组腺相关病毒（recombinant adeno-associated virus, rAAV）作为基因治疗载体，预计到2030年，rAAV的应用市场将增长43%。然而，受限于rAAV的生产效率，基于rAAV的基因治疗成本昂贵。因此，提高rAAV生产效率是降低生产成本的关键，有利于促进这一新兴治疗模式在罕见病领域的发展。
目前，基于三质粒系统瞬时转染人胚胎肾细胞（human embryonic kidney 293 cells, HEK293）的方法是rAAV生产的主流，质粒结构优化和转染工艺优化是提高瞬时转染表达系统的rAAV生产效率常用的方法。其中，质粒结构的优化包括启动子的种类、添加不同的基因表达调节元件等的优化。虽然通过上述优化能够显著提升现有的三质粒系统生产rAAV的能力，但该系统上的多个基因元件始终按照固有的顺序和组合连接，且这些基因元件及其组合方式对rAAV生产的影响尚不明确，导致现有的工艺水平难以实现进一步突破。因此，深入认识传统三质粒系统中各基因对rAAV生产的影响，进而合理地优化质粒的设计是提高rAAV产量的关键。
近日，《生物技术通报》在线发表了题为《重组腺相关病毒瞬时表达系统的理性设计及其高效生产工艺的建立》的研究报告。本研究在剖析传统三质粒系统局限性的基础上，分析病毒基因与辅助病毒基因的组分及其连接方式对rAAV生产过程的影响，从而重新设计更为合理的新型三质粒系统。然后通过优化转染时质粒与细胞的比例、质粒与转染试剂的比例、细胞密度以及三质粒比例，建立新型三质粒瞬时转染包装rAAV的生产工艺。本研究期望通过优化质粒系统设计和关键工艺参数提高rAAV的生产水平，为rAAV的高效工业化生产提供参考，也为其他病毒载体的理性设计与生产工艺优化提供思路。
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随着基因治疗的发展，对rAAV的需求日益增长，提高rAAV的生产效率至关重要。目前，利用质粒瞬时转染HEK293细胞是rAAV的主流生产方式。然而，传统三质粒系统的生产效率较低，难以满足当前临床应用的需求。因此，本研究深入分析了传统三质粒系统中影响rAAV生产的关键因素，明确了rep和cap基因的组成和比例以及辅助病毒基因的关键序列对rAAV生产的影响，合理地设计新型三质粒瞬时表达系统，使rAAV的产量提高了2.6倍。此外，通过优化新型三质粒系统的生产工艺，rAAV的产量进一步提高了3.7倍。
本研究在拆分rep和cap基因的同时将其病毒内源性启动子替换为CMV启动子，显著提高rep和cap基因的转录水平，然而GOI上携带的绿色荧光蛋白的表达水平降低。这可能是由于病毒基因组上携带的GOI的表达和病毒的生产为竞争关系，随着病毒蛋白转录水平的提高，可能导致细胞内的资源在病毒蛋白和荧光蛋白表达之间的重新分配。当携带rep基因质粒比例过高时，Rep蛋白的过量表达可能会对rAAV的生产过程产生不利影响，从而导致rAAV产量的下降。当携带cap基因质粒的比例增加时，Cap蛋白的转染量也随之增加，这有助于更多的病毒颗粒完成包装过程，从而提高rAAV的产量。因此，Cap蛋白表达水平的增加对rAAV的产量提升具有促进作用。合理的Rep蛋白和Cap蛋白表达比例对rAAV的生产至关重要。
此外，本研究通过截短辅助病毒基因重构了辅助质粒，与目前可用的质粒相比，其尺寸更小并保持了全部的辅助功能。由于辅助病毒蛋白来源于腺病毒，具有一定的细胞毒性，会影响宿主细胞的正常生理状态。因此，本研究中删除了非必需冗余序列，并且通过实验证实冗余序列的缺失不会影响rAAV的生产。本研究通过对包装质粒和辅助质粒的重新组合设计有效地增加rAAV的产量。然而，并非任意的质粒组合都可达到增产效果，这可能由于质粒上病毒基因元件的表达影响病毒DNA的合成、衣壳蛋白的合成以及病毒的包装过程，从而影响了rAAV的产量，其影响机制有待进一步研究。
本研究通过考察rAAV瞬时表达系统中不同的基因设计对病毒产量的影响，设计了两种新型三质粒系统，其中rep基因和E4orf基因相连、cap基因和DBP基因相连的AAV-RepE4质粒系统生产rAAV基因组滴度达到（1.64±0.3）×1011 vg/mL，较传统三质粒系统提高2.6倍。然后，基于新型三质粒系统建立了当质粒与细胞比例为2μg/106 cells、PEI和质粒的比例为3∶1、细胞密度为3×106 cells/mL、三质粒摩尔比为1∶1∶1时的高效生产工艺，最终rAAV的产量达到7.8×1011 vg/mL，单细胞产量达到1.5×105 vg/cell，处于行业较高的水平。
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