基于计算设计的GH11家族木聚糖酶CDBFV的热稳定性改造及潜在机制研究
韩雪，张阿娜，王海燕，辛凤姣，谷天一，王钰璐
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0384
半纤维素与纤维素和木质素相连，共同构成植物细胞壁的整体结构，是自然界中丰富的可再生生物质资源。木聚糖是半纤维素的最主要成分，约占细胞壁干重的15%-40%，是仅次于纤维素的第二多糖。木聚糖的降解需要多种酶的协同作用，其中，内切木聚糖酶（以下简称木聚糖酶）是降解过程中最关键的酶，其随机切割主链中的β-1,4糖苷键，产生低聚木糖。木聚糖酶在造纸、纸浆、食品和饲料等行业应用广泛，因而受到科研及产业界的诸多关注。木聚糖酶的活性和热稳定性是影响其工业应用的核心因素。然而，目前工业上广泛应用的木聚糖酶多属于中温酶，尽管已有研究从嗜热微生物中分离出部分耐高温的木聚糖酶，但它们的表达量和酶活性仍未达到工业生产的需求。因此，开发新型耐高温木聚糖酶或对现有酶进行热稳定性改造十分重要。
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本文主要包括以下几部分内容：
2.1 突变位点的设计
2.2 CDBFV及其单突变体在大肠杆菌中的重组表达、纯化及酶学性质表征
2.3 双突变体在大肠杆菌中的重组表达、纯化及酶学性质表征
2.4 双突变体在毕赤酵母中重组表达、纯化及酶学性质表征
2.5 双突变体热稳定性提高的分子机制分析
3 讨论
基于催化区域的序列特征，木聚糖酶主要分布在糖苷水解酶（GH）10和11家族，少数分布在5、8、30和43家族。与其他家族木聚糖酶相比，GH11家族因其严格的底物特异性、高催化效率、耐高温和耐碱性而备受关注。结构分析显示，与嗜中温木聚糖酶相比，嗜热木聚糖酶内部具有更多的氢键、疏水相互作用和二硫键，整体刚性更强。研究表明，通过将柔性氨基酸刚性化、增强残基间相互作用、引入N-糖基化修饰等策略有助于提高木聚糖酶的热稳定性。近年来，随着人工智能在酶学领域的应用，机器学习也为酶的蛋白质工程改造提供了诸多便利。
本研究使用MD模拟、序列比对、机器学习等策略构建的N37P、N38V、N88G、N37P/N88G突变体，其热稳定性均有提高，其中N37P/N88G在85℃的热稳定性高于目前报道的木聚糖酶，同时我们发现用毕赤酵母表达蛋白的最适温度和热稳定性进一步提高。在酶设计与改造中，酶活力与热稳定性之间的权衡效应是面临的主要挑战。本研究针对CDBFV酶远离活性中心的N端基序36GNNS39进行改造，并发现当在大肠杆菌中表达突变体时，尽管其热稳定性得到了提升，但绝对酶活却降低了20%-50%。通过MD分析，我们发现N37P/N88G双突变体显著增强了酶的刚性，从而提高了其热稳定性。然而，这种改造间接影响了活性位点附近151SIDGD155基序的结构，降低了此区域的柔性，从而对酶活力产生了不利影响。对于大肠杆菌和毕赤酵母表达后酶活力的变化，分析其可能与毕赤酵母系统中存在的多种修饰有关。毕赤酵母系统表达的野生型酶较大肠杆菌表达的酶具有额外的糖基化修饰，这些修饰可能进一步稳定了酶的结构，但同时也降低了酶活力。而双突变体酶恰好突变了潜在的糖基化位点（N37和N88），导致在两个不同表达系统中，突变体酶性质相当。该结果表明，糖基化是影响两个表达系统中酶活力和热稳定性差异的关键因素。通过选择合成的表达系统，可以更有效改善酶活力和热稳定性之间的权衡问题。综上，本研究为高温环境下CDBFV酶的广泛使用奠定基础，其设计改造思路可以为改造GH11家族的其他木聚糖酶提供指导，为饲料、食品等工业领域提供更高效、稳定的酶制剂。
本研究采用计算机辅助的理性设计对来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶CDBFV进行热稳定性改造，构建了单点突变体N37P、N38V、N88G及双突变体N37P/N88G均能显著提升酶的热稳定性，其中双突变体表现最好，在毕赤酵母表达系统中，其在85℃处理3 min后的剩余活力为88.8%，比野生型CDBFV（76.6%）提高了12.2%，为工业化耐热木聚糖酶的应用奠定了基础。
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