焦丹荣，马梦雪，何柏水，谢龙，左二伟
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0673
近日，《生物技术通报》在线发表了中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）左二伟团队题为《高保真CRISPR/Cas9系统在家禽细胞中的编辑特性研究》的研究报告。本研究选用与禽流感病毒在鸡细胞中复制的重要关联基因ANP32B，以及与家禽生殖与繁殖相关的基因DAZL作为打靶对象，针对其外显子区域设计打靶位点，分别使用具有高保真特性的HiFiCas9，HypaCas9, eCas9, SuperFi-Cas9变体进行打靶，同时使用野生型的SpCas9以及可能具有更广泛脱靶效应的RYCas9作为阳性对照，进行了几种高保真编辑器编辑特性与脱靶特性的评估研究，为更好利用高保真编辑器进行家禽的遗传育种、遗传资源应用等研究提供参考。
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SpCas9是目前使用范围最广的CRISPR/Cas基因组编辑工具，研究人员为了降低非目标位点编辑，增强特异性，开发出高保真核酸酶，然而大多数高保真编辑器有降低脱靶的趋势的同时，也会对原有的编辑效率产生影响。与此同时，对于不同的物种、PAM序列要求以及sgRNA序列长度，各个高保真编辑器的编辑效果均不相同。因此，通过选取合适的高保真编辑器对鸡禽流感相关受体基因进行基因编辑，在家禽细胞中保证原有的效率不发生大幅度降低的情况下保证基因编辑的特异性，培育出具有较强的抗病能力的鸡品种存在广阔的应用前景和研究价值。
随着基因编辑技术的逐渐发展，例如HypaCas9等高保真编辑器在人类细胞方面的应用日渐成熟，但在例如家禽的其他物种中，高保真编辑器的应用与推广仍然需要相关数据的支持。在本研究中，为了评估不同高保真编辑工具在家禽中的编辑特性，我们通过使用不同的高保真编辑器在鸡的ANP32B、DAZL基因上进行敲除，比较其编辑情况。结果显示，家禽细胞中高保真编辑器eCas9在低脱靶的情况下仍然保持较高的编辑效率，HIFICas9次之。与在人类HEK293T细胞上编辑情况不同的是，在HEK293T中表现较好的HypaCas9在家禽的细胞中反而表现出较低的编辑效率。同时，我们发现SuperFi在多种高保真编辑器中，具有较好的特异性，但部分位点中的编辑效果较差，这与它在人类细胞中的编辑特性的相关报道类似。
综上所述，高保真CRISPR/Cas9编辑工具可以显著降低鸡的基因编辑中的脱靶效应，其中eCas9在具有高保真特性的同时具有较好的编辑效果，而SuperFiCas9则表现出最高的特异性。这两个编辑器也因此在鸡高保真基因编辑的相关应用中具有良好的前景，在鸡分子育种和食品安全领域有着巨大潜力。本研究探索了高保真CRISPR/Cas9编辑工具在家禽细胞中的编辑与脱靶特性，为鸡重要经济性状的遗传改良及分子定向育种研究中高保真编辑工具的选择提供了数据支持。
本研究经分子生物与细胞功能验证，确认多种高保真碱基编辑器在家禽细胞中的编辑活性，其中SuperFiCas9表现出最高的特异性，但在不同位点中编辑效率区别较大；而eCas9在表现高效编辑的同时，有效降低了脱靶效应。
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