大肠杆菌E.coli DH5α通过外膜囊泡传递抗生素抗性基因AmpR
庄棵，梁至轩，何英婷，谢秋玲
DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0335
细菌抗生素耐药性的传播已成为一个关键的全球公共卫生问题，多重耐药细菌的传播引发一系列严重感染和环境污染，对人类健康和生态环境造成严重威胁。越来越多的研究探讨了细菌耐药性发展和传播的可能机制。抗生素抗性基因（ARGs）是细菌产生耐药性的分子基础。细菌耐药性的产生可能是内在的，可能是通过自发突变获得的，也可能是由于供体细菌、噬菌体或游离DNA向受体细菌的水平基因转移（HGT）造成的。质粒是遗传物质交换最具活力的载体，大多数ARGs是由质粒编码的，细菌可通过质粒的水平传播获得抗性基因，产生携带ARGs的抗性克隆，然后可以在环境中传播，人与人、动物和生态系统之间的相互联系可能会导致耐药性的传播。
外膜囊泡（OMVs）是一种由革兰氏阴性菌产生的，大小为20-250 nm的双层纳米级球形囊泡。OMVs携带多种亲本物质，具有多种生物学功能，包括细胞通讯、水平基因转移、毒素输送和调节免疫反应等。近年来的研究表明，除了接合、转导和转化等水平基因转移方式外，OMVs是另一种新的基因转移方式，可以作为抗性基因、毒力基因和质粒的转移载体。OMVs可以保护管腔中的DNA免受核酸酶的侵害，据报道，OMVs还可以保护DNA免受热降解。越来越多的证据表明OMVs与耐药性的传播之间具有相关性。
利用质粒过度表达基因是构建基因工程菌的主要方法，由于工程菌具有繁殖力强、适应性好等能力，可能会与环境中其他生物发生水平基因转移（HGTs），对生态环境和人类健康造成不良风险。另外，质粒上通常都携带有抗生素抗性基因（ARGs）作为筛选标记和其他的外源基因，因此未经处理的工程菌和培养基直接流入下水道，如果质粒不丢失，最终被排放到河流或者用于农业用地后可能会造成ARGs和外源基因在环境中广泛传播，可能会造成高耐药性细菌和多重耐药菌的出现。人们日益认识到遏制抗生素耐药性出现的紧迫性，所以研究工程菌是否存在传播抗生素耐药性的风险及其作用机制对于认识基因工程微生物的安全性风险和预防高耐药性细菌的出现具有十分重要的意义。众所周知，大肠杆菌常用作蛋白质高效表达的首选体系，大肠杆菌的遗传灵活性使其可能成为ARGs的有效接受者和传播者。据报道，OMVs可以介导ARGs在肠杆菌科细菌中传播，但是目前关于OMVs是否参与调控基因工程菌耐药性的传播以及具体作用机制的研究尚不清楚。大肠杆菌Escherichia coli DH5α是一种广泛用于基因克隆和表达等方面的实验室菌株，其本身对氨苄青霉素敏感。
近日，《生物技术通报》在线发表了题为《大肠杆菌E.coli DH5α通过外膜囊泡传递抗生素抗性基因AmpR》的文章。本研究中我们选择一株转化了携带氨苄青霉素抗性基因质粒的基因工程菌Escherichia coli DH5α作为研究对象，研究其产生的OMVs是否携带抗性基因AmpR，并进一步探究AmpR通过OMVs在细菌之间传递的情况，对携带耐药质粒的基因工程菌E.coli DH5α耐药基因的传播机制研究以及基因工程菌可能对环境造成耐药基因污染等方面具有重要意义。
本文现已在知网上线，欢迎下载阅读！
本实验首先通过超速离心法从大肠杆菌培养上清液中提取出OMVs，随后通过透射电子显微镜（TEM）观察到OMVs具有球形囊泡状结构，根据纳米颗粒跟踪分析（NTA）结果表明，无论是否携带载体，E.coli DH5α在对数生长期会释放出囊泡，粒径大小基本一致，峰值大约都在110 nm附近，但是对于两者分泌的OMVs中内容物的差异还需要进一步的实验去探索。外膜孔蛋白C（OmpC）是一种常见于革兰氏阴性菌外膜中的蛋白质，也是OMVs的一种组成成分，有研究证实了OmpC是大肠杆菌OMVs中最丰富的蛋白质。我们的结果表明E.coli DH5α产生的OMVs中外膜蛋白OmpC呈阳性，也进一步说明成功提取了E.coli DH5α的外膜囊泡。
本研究通过提取转化了pET-22b载体（携带AmpR）的E.coli DH5α的外膜囊泡，验证了OMVs中存在氨苄抗性基因AmpR，之后将OMVs和E.coli DH5α共孵育，通过菌落PCR鉴定了E.coli DH5α中AmpR的存在。
推荐阅读
亮点文章 | CRISPR/Cas9介导的adeG基因敲除大肠杆菌细菌模型的建立
欢迎订阅：
1. 各地邮局订阅：邮发代号18-92
2. 科学出版社期刊发行部：电话 010-64017032；010-64017539
3. 网上购买：扫描下方二维码或在淘宝、微店搜店铺名称“中科期刊”可直接订阅
投稿、转载信息发布及合作等事宜请联系:010-82109925/82109903
官方唯一投稿系统：http://biotech.aiijournal.com
长按关注：生物技术通报
