周家伟，武志强
DOI: 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0657
植物细胞核基因功能的研究通常借助于基因编辑技术。植物线粒体基因编辑面临两大技术瓶颈：一方面，陆地植物线粒体基因组的稳定遗传转化还未实现；另一方面，基于CRISPR/Cas9的线粒体基因编辑技术尚未在植物中实现同质化编辑。因此，只能选择仅含有核酸酶组分的TALENs技术以实现线粒体基因编辑。2019年，日本东京大学有村慎一课题组利用带有线粒体定位信号(MLS)的TALENs技术——mitoTALENs，首次在国际上实现了陆地植物线粒体基因编辑，之后mitoTALENs技术相继成功应用于多种植物的线粒体基因功能研究。由于mitoTALENs技术具有编辑效率高、能实现多拷贝线粒体基因组的同质化编辑及突变体后代能够稳定遗传的特点，被越来越多的研究者所关注。但mitoTALENs载体构建过程较为繁琐复杂，且目前缺乏较为详细完整的载体构建方法，这在一定程度上限制了该技术在国内外相关研究领域的广泛应用。
TALENs是由一对结构相同的TALEN-left和TALEN-right组成，每个结构都由N端的核定位信号(NLS)、中间的DNA识别结合结构域(TALE 阵列)和C端的Fok I核酸酶组成。其中，DNA识别结合结构域是一段长的串联重复序列，每个重复单元由33-35个氨基酸残基组成，其中第12和第13位的氨基酸组合在一起称为重复可变双残基(RVD)，能够特异性地识别一个碱基即，HD ：C，NG ：T，NI ：A，NN或NK ：G。根据这个原理，能够针对特定靶点进行串联重复序列的组装。当两个Fok I核酸酶形成二聚体时会对特定DNA序列进行切割导致双链断裂，然后通过相关机制进行修复从而达到定向修饰的目的。mitoTALENs是在TALENs技术的基础上将其N端的NLS换成了MLS，通过细胞核遗传转化的方法将mitoTALENs载体中的T-DNA插入受体细胞的细胞核基因组上，然后在细胞质中表达出左右“MLS-TALE-Fok I”融合蛋白，最后“TALE-Fok I”融合蛋白进入线粒体对目的基因/片段进行靶向修饰。
mitoTALENs的载体构建是通过Platinum Gate TALEN的两步组装技术和multisite LR反应实现的。首先，通过两步组装技术构建TALEN-left和TALEN-right载体。对TALEN载体中串联重复序列的两步组装均依据于酶切和酶连的方法，即利用限制性内切酶消化产生多个带有特定黏性末端的游离目的片段及线性载体。如 p1NI-p4NI、p1NG-p4NG、p1HD-p4HD和p1NN-p4NN载体中含有NI、NG、HD和NN重复单元的上下游序列均含Bsa I酶切位点，经Bsa I酶消化后p1系列重复单元均含有游离的5'-ACCC-和-CTGG-5'黏性末端，p2系列重复单元均含有游离的5'-GACC-和-ACTG-5'黏性末端，p3系列重复单元均含有游离的5'-TGAC-和-GACT-5'黏性末端，及p4系列重复单元均含有游离的5'-CTGA-和-GGAC-5'黏性末端。而经Bsa I酶消化后获得的pFUS2_a系列线形载体均含有-TGGG-5'和5'-CCTG-黏性末端，pFUS2_b1线形载体含有-TGGG-5'和5'-GACC-黏性末端，pFUS2_b2线形载体含有-TGGG-5'和5'-TGAC-黏性末端，pFUS2_b3线形载体含有-TGGG-5'和5'-CTGA-黏性末端，pFUS2_b4线形载体含有-TGGG-5'和5'-CCTG-黏性末端。然后，通过Quick ligase可将这些目的片段按照理想顺序连接到线性载体上，这是第一步组装的原理。第二步组装采用相同的原理，利用Esp3I 酶对pFUS2_a、pFUS2_b载体及进入载体进行酶切获得目的片段和线形载体，然后通过Quick ligase进行连接分别产生TALEN-left和TALEN-right载体。最后，利用multisite LR反应将分别含有TALEN-left和TALEN-right组分的载体、含有其他功能原件的载体及目的空载体进行反应，最终生成mitoTALENs表达载体。
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本文主要包括以下几部分内容：
2.1 第一步组装结果
2.2 第二步组装结果
2.3 multisite LR反应结果
3 讨论
以水稻线粒体WA352基因为例，详细介绍了mitoTALENs植物线粒体基因编辑载体构建过程中的TALE阵列组装方法及成功生成终载体的multisiteLR反应条件。
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