在自然界众多复杂分子中，氮杂环结构扮演着举足轻重的角色，它们广泛分布于天然产物、药物活性成分及农用化学品之中，据统计，高达59%的现市售小分子药物均蕴含此类结构。因此，探索高效、简洁的C-N键构建方法成为了现代合成化学领域的一项核心任务。尽管烯烃与未活化胺之间的氢胺化反应在原子经济性上展现出极大优势，但特定类型的C-N键构建——尤其是通过1,1-二取代烯烃与胺的马氏氢胺化途径不对称合成α-叔胺——仍面临重重挑战。传统上，过渡金属催化剂虽常用于此类反应，却在构建大位阻键时显得力不从心；而小分子催化的自由基氢胺化虽展现出良好的官能团兼容性，却仅限于生成反马氏产物，且难以实现不对称控制。近年来，Brønsted酸催化策略虽有所突破，却对官能团耐受性有限，且需依赖特定导向基团的失活胺来确保对映选择性。相比之下，酶作为自然界的催化高手，凭借其独特的活性中间体及与底物间复杂的相互作用网络，为实现高选择性化学转化提供了无限可能，尤其是在那些传统催化剂难以触及的反应领域。然而，直至最近，尚未有报道揭示任何生物催化剂能催化未活化胺与烯烃间的氢胺化反应。
在这一背景下，美国普林斯顿大学的Todd K. Hyster教授团队凭借其在黄素依赖酶促反应领域的深厚积累，再次取得突破性进展。他们巧妙地运用光酶催化策略，成功解锁了烯烃氢胺化的新路径（图示1b），不仅以中等至高产率和卓越的对映选择性合成了一系列手性2,2-二取代吡咯烷衍生物，更意外揭示了一种前所未有的C-N键形成机制：即通过光还原产生的苄基自由基与氮原子孤对电子间的空间相互作用，巧妙促成了C-N键的构建，这一发现发表于《Nature》杂志。
研究团队首先以烯基胺1作为模型底物，对分子内氢胺化反应条件进行了系统优化（图示2a）。结果显示，醋酸钙不动杆菌来源的环己酮单加氧酶（AcCHMO）能够催化反应，以1%的产率和55:45的对映体比率（e.r.）生成了5-exo-trig氢胺化产物2，而非预期的6-endo-trig产物3。对照实验强调了CHMO酶与光照的必要性，同时排除了游离黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的直接催化作用。进一步筛选CHMO同源酶库，发现了奥美拉唑亚砜酶（AcCHMO-M10），其催化效率提升至12%产率和相同的对映体比率。随后，通过迭代位点饱和突变（ISM）技术（图示2b、2c），研究团队鉴定出R490E、C326H、I491T和A479H这四个关键突变，它们协同作用，将产率提升至97%，对映体比率优化至95:5。分子动力学（MD）模拟揭示了这三个远端突变位于一个动态环区（残基475-510），该区域作为通往酶活性位点的通道（图示2d），其构象变化对于提高底物可及性和保持活性位点开放性至关重要，从而直接促进了产率的显著提升（15-30%）。值得注意的是，即使在极低催化剂负载量（0.04 mol%）和无细胞透析裂解物条件下，反应仍能以15%的产率（转化数TON=436）和95:5的对映体比率进行，尽管在未透析裂解液中对映选择性略有下降（93:7）。
接下来，研究团队选用AcHYAM（HYdro AMinase）作为催化剂，广泛探索了反应的底物适用范围（图示3）。结果显示，无论是苯环上带有吸电子还是给电子取代基的苯胺（2-12）及苯乙烯（13-22），均能顺利参与反应，以中等至优异的产率和对映选择性生成目标产物，尤其是富电子芳烃表现出更佳的反应性能（如2、4-10、13-20）。特别值得一提的是，即使苯胺（10）或苯乙烯部分（19）携带大位阻取代基（如萘），或是缺电子含氮杂环（11-12、21），反应依然能够顺利进行，这一特性有效克服了Brønsted酸催化环化中的局限性。尽管某些杂环取代基的环化反应较为敏感且易受阻碍，但通过蛋白质工程策略有望克服这些难题。例如，一种同源底物能够经历6-exo-trig环化，以13%的产率和78:22的对映体比率生成产物22，而在传统光氧化还原催化条件下，此类底物往往倾向于发生1,5-氢原子转移（HAT）过程。此外，该方法还成功应用于制备三种具有药用价值的含芳基吡咯烷衍生物的α-甲基化变体，包括TRK抑制剂GNF-862541的甲基化吡咯烷片段24（产率85%，e.r. 94:6）、原肌球蛋白抑制剂Larotrectinib的α-甲基修饰片段26（产率77%，e.r. 75:25）及其相关结构25（产率25%，e.r. 73:27），进一步展示了该策略的实用价值和广泛应用潜力。
Emergence of a distinct mechanism of C–N bond formation in photoenzymes
Felix C. Raps, Ariadna Rivas-Souchet, Chey M. Jones, Todd K. Hyster
Nature, 2024, DOI: 10.1038/s41586-024-08138-w
