摘要：流感病毒通常引起季节性流感流行和流感大流行，导致急性呼吸道疾病，严重情况下甚至会导致多器官并发症和死亡，给全球和人类健康带来严重负担。与其他国家相比，中国拥有庞大的人口基数和大量的流感病例及死亡人数。目前，流感疫苗接种仍然是预防和控制流感最经济有效的手段，可以显著降低流感病毒感染和严重并发症的风险。当流感疫苗的抗原性与季节性流行株相匹配时，显示出良好的保护效果。然而，当流感病毒经历快速且持续的抗原漂移，导致疫苗株与流行株不匹配时，保护效果大大降低。因此，流感疫苗必须每年重新配制和重新接种，这消耗了大量的人力和财力资源。因此，开发通用流感疫苗对于全面对抗流感病毒是必要的。本文通过统计分析近年来中国与流感病毒感染和死亡相关的病例，描述了中国现有的上市疫苗、疫苗分发和接种情况，并总结了基于流感病毒结构设计的候选免疫原，希望能为未来新流感疫苗的设计和开发提供思路。
1.引言
流感是由流感病毒引起的急性呼吸道感染，严重危及人类和动物健康，在严重情况下可能导致死亡。自20世纪以来，人类历史上发生了几次流感大流行，其中最灾难性的是1918-1919年的“西班牙流感”，全球约有5000万人死亡，以及1957-1958年的“亚洲流感”、1968-1969年的“香港流感”、1976年的“猪流感”、1977年的“俄罗斯流感”和2009年的甲型流感，这些也造成了数百万人死亡。另一方面，人类感染禽流感病毒（AIV）构成了持续的公共卫生威胁。根据它们在鸡中的致病性，AIV被分为两种病原型，低致病性禽流感（LPAI）和高致病性禽流感（HPAI）。首次记录的由HPAI病毒引起的人类死亡发生在1997年的香港，当时H5N1病毒感染了18人，造成6人死亡。第二次主要的AIV人畜共患疾病是由H7N9病毒引起的，该病毒于2013年在中国首次被检测到。自那时以来，已造成超过1500例人类病例，病死率为39%。控制禽流感已成为人类公共卫生的共同而艰巨的任务。目前的流感病毒疫苗是有效的，但前提是它们与流行株相匹配。大流行性流感和季节性流感在全球范围内造成了相当大的发病率和死亡率，对公共卫生和全球经济构成了严重威胁，世界卫生组织（WHO）估计季节性流感每年导致约300万至500万例严重病例和29万至65万人死亡。孕妇、婴儿和幼儿、老年人和患有慢性基础疾病的患者更容易因流感而患上严重疾病和死亡。中国拥有超过14亿人口，流感的发病率和死亡率负担很大，但流感流行的发展尚不清楚。本文通过统计分析近年来中国与流感病毒感染和死亡相关的病例，描述了中国现有的上市疫苗、疫苗分发和接种情况，并总结了多种流感疫苗候选免疫原和疫苗设计策略，为未来新流感疫苗的设计和开发提供思路。
2.中国流感的流行病学
中国的流感病毒研究始于1952年，导致1957年建立了国家流感中心，随后在2000年建立了流感监测网络，重点关注流感样病例报告和病毒分离，全面提高了中国流感监测的整体能力。自2009年以来，中国的流感监测网络已逐步扩大和改进，现在包括554家哨点医院和410家网络监测实验室，覆盖中国大陆所有省份、直辖市和自治区。哨点医院向中国国家流感监测信息系统（CNISIS）报告流感样疾病（ILI）病例，并收集呼吸道样本。网络实验室使用实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）来确定收集的样本是否对流感病毒呈阳性。
2.1.近年来中国流感感染和死亡病例分析
中国大陆拥有超过14亿的总人口，流感的发病率和死亡率负担很高。根据国家卫生健康委员会疾病预防控制局报告的2009年3月至2022年8月（截至2022年11月17日，图1a，b）中国大陆流感感染和死亡数据，流感流行和与流感相关的死亡主要集中在冬季（1月至3月和11月至12月），7月至10月期间报告的流感发病率最低。2019年的流感流行最为严重且持续时间最长，2月至6月以及11月至12月期间，12月报告的流感病例数量最多，约120万人（图1a）。随后的1月死亡人数最多，为108人。据报道，与流感相关的死亡集中在1月至3月和11月至12月期间（图1b），但流感病例的病死率没有季节性模式（图1c）。
在2009-2017年期间，每年的流感感染和死亡人数相对较低，发病率和死亡率较低（图1d，e），但在2018-2020年期间，流感感染和死亡人数大幅增加，死亡率也相应上升，可能是由于流感监测网络的扩大和流感病例报告的及时性和准确性提高。2019年之后的季节性流感感染和相关死亡人数低于SARS-CoV-2出现之前，可能是因为对SARS-CoV-2的预防控制也在一定程度上控制了流感流行。总体年度发病率和死亡率没有明显的特征（图1f）。随后，2021年的流感病例数量很低，除了11月至12月期间的轻度流行。
2.2.中国流感病毒亚型及季节性和地域性特征
目前，在中国引起季节性流感的主要流感病毒亚型是甲型H1N1/pdm09流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒。根据Diamond等人对中国大陆流感相关健康结果的回顾和分析，每种流感亚型表现出显著不同的平均流行持续时间，甲型H3N2流感的平均持续时间最长，约为每年4.83个月，其次是乙型和甲型H1N1pdm09流感，平均长度分别为3.57个月和2.33个月。独立于纬度，甲型H1N1/pdm09和乙型病毒谱主要在冬季发生，分别在1月和2月达到高峰，而甲型H3N2病毒在全国范围内差异很大，高纬度地区（例如辽宁省）在冬季流行，中低纬度地区（例如福建省）在夏季流行。在所有省份中，1月是活动高峰月，平均阳性率为21.8%，10月的平均阳性率最低，为4.37%。此外，中国大陆的年度流感流行根据纬度而变化。中国高纬度省份的流感流行特征是冬季流行，持续时间短但流行强度大，而中低纬度省份则流行强度弱但持续时间长，为半年流行（例如浙江省和安徽省）或全年流行（例如海南省）。
2.3.流感流行病造成疾病和经济负担
根据国家哨点医院的流感样病例(ILI)监测和病毒学数据，Feng等人计算了2006年至2015年中国30个省份流感相关咨询的全国平均比率，发现每1000人中有2.5次咨询，这一数字在2009年流感大流行期间达到每1000人7.8次咨询的高峰。Gong等人进行了文献综述，估计2006-2019年中国每年因流感导致的ILI门诊急诊额外就诊次数为2,346,000至3,005,000次，严重急性呼吸道感染住院次数为92,000次，呼吸系统疾病额外死亡人数为92,000人；Li等人使用22个中国省份的数据拟合了线性回归模型，估计2010-2015年期间，中国每年平均有88,100人因流感相关额外呼吸系统死亡，相当于所有呼吸系统死亡的8.2%。值得注意的是，流感相关额外呼吸系统死亡率的估值在研究的省份之间表现出空间差异，即中国东部和西部省份的估值高于中部省份的估值，可能由于西部的医疗服务不完善和东部的高人口密度，这增加了流感传播的风险。
除了对人们的生命和健康造成严重负担外，流感还对个人和国家造成巨大的经济损失，全球每年的间接经济损失高达数十亿美元。中国是流感易发地区，大多数关于流感相关经济负担的研究都集中在经济更发达的地区；例如，北京、上海和天津的流感样病例(ILI)负担最高，青海、甘肃和宁夏的ILI负担最低。这可能与各省之间经济发展的差异和不同的健康寻求行为模式有关，在经济发展中等的省份，个人可能选择用药而不是去门诊咨询。中国门诊流感病例的直接医疗费用范围为186至804元人民币；直接非医疗费用范围为7至212元人民币；间接费用范围为139至963元人民币；总经济负担范围为464至1320元人民币。此外，住院流感病例的直接医疗费用范围为2625至20,712元人民币；直接非医疗费用范围为1200至1809元人民币；间接费用范围为204至2408元人民币。总经济负担范围为9832至25,768元人民币。Chen等人评估了2011-2019年中国季节性流感造成的年度经济损失约为330亿至1060亿元人民币，相当于2019年中国GDP的0.03%至0.1%。仅在2019年，与流感相关的总经济负担为263.81亿元人民币，约占当年GDP的0.266%，其中住院病例、急诊门诊病例和过早死亡分别占总经济负担的86.4%、11.3%和2.4%。
上述研究表明，流感流行不仅造成严重的健康影响，还带来重大的经济负担，迫切需要采取措施控制流感流行，而接种疫苗是最具成本效益的手段。
3.中国的疫苗和接种状况
流感疫苗是预防和减少流感相关严重疾病和死亡的有效手段，同时减少与流感相关疾病相关的健康风险和医疗资源使用。三价疫苗包括一种流感A型H1N1、A型H3N2和流感B型病毒Victoria或Yamagata株，而四价疫苗包括流感A型H1N1、H3N2和流感B型病毒Victoria和Yamagata株，覆盖范围广泛。世界卫生组织根据北半球鸡胚生产的疫苗推荐了2022-2023年三价流感疫苗成分：A/Victoria/2570/2019（H1N1）pdm09类似株、A/Darwin/9/2021（H3N2）类似株和B/Austria/1359417/2021（Victoria系）类似株。四价流感疫苗成分包含两种B型株，上述三种株和B/Phuket/3073/2013（Yamagata系）类似株。与前一年相比，A（H3N2）亚型和B（Victoria）系病毒更换了株。
中国目前批准上市的流感疫苗有三价灭活流感疫苗（IIV3）、四价灭活流感疫苗（IIV4）和三价减毒活疫苗（LAIV3）。IIV3包括灭活疫苗和亚单位疫苗；IIV4是一种灭活疫苗；LAIV3是一种减毒疫苗。截至2022年8月14日，已有11家制造商供应流感疫苗，具体流感疫苗制造商及其产品信息见表1。流感继续对公共卫生构成重大威胁，接种疫苗是应对流感的最有效手段。目前，可以通过添加佐剂来刺激免疫原性、优化病毒株预测手段和使用高剂量注射疫苗为免疫受损人群提高多价流感疫苗的有效性。
6-35个月婴儿的灭活流感病毒疫苗剂量为0.25 mL/剂，每剂含有7.5微克的HA抗原组分，通常需要两剂才能达到免疫保护；3岁及以上儿童的灭活流感病毒疫苗剂量为0.5 mL/剂，每剂含有15微克的HA抗原组分，仅需一剂。三价减毒活疫苗的抗原含量标准为流感A型病毒H3N2和H1N1的两种亚型每剂不少于6.9 lgEID50（50%鸡胚传染性剂量，EID50）的减毒病毒滴度，以及流感B型病毒Victoria系每剂不少于6.4 lgEID50的减毒病毒滴度，剂量为0.2 mL/剂，适用于3-17岁的儿童和青少年。
图2显示了2015年至2020年中国流感疫苗行业的批签发量统计。2018年中国流感疫苗的批签发量为1612.39万剂，是近年来最低的。2019年有所增加，流感疫苗批签发量为3078.42万剂，比前一年增加了1466.03万剂。2020年流感疫苗的批签发量达到5751.99万剂，比前一年增加了2673.57万剂，2021年之后将不再公布批准的流感疫苗数量。中国四价流感疫苗于2018年首次获批上市，据统计，2018年、2019年和2020年分别批准了512.25万剂、971.05万剂和3358.23万剂。自推出以来，四价流感疫苗的发行数量逐年增加，2020年的比例超过了三价流感疫苗，达到了58.38%。
图 2.近年来中国流感疫苗行业的批签发量。
根据统计，2014年至2020年，中国流感疫苗的平均接种率为2.43%，其中2018年的最低接种率为1%，到2020年提高至4%，而根据美国疾病控制与预防中心的数据，2020年流感季节期间，美国分发了1.75亿剂流感疫苗，成人接种率约为48.4%，相比之下，中国不到10%。这种低接种率的可能原因包括：中国尚未将流感疫苗纳入国家免疫规划，免费接种政策实施的地区覆盖有限，民众对流感和流感疫苗的认识不足，疫苗供应不足，现有的流感疫苗种类单一且需要每年重新接种。由于中国目前流感疫苗接种率较低，群体免疫屏障的保护脆弱，一定程度上，流感疫情很容易发展成流行趋势。中国仍需进一步提高流感疫苗接种率，可以采取的措施包括：首先，逐步将特定风险群体的流感疫苗接种纳入国家免疫规划和地方公共卫生项目中。其次，增加目标群体如儿童、老年人和医务人员的接种率。第三，努力推广联合接种，并积极优化流感和其他疫苗的联合接种程序，以此提高免疫服务的效率。
4.通用流感疫苗的开发
流感病毒属于正黏液病毒科，是一种包膜单链负义RNA病毒，其基因组编码11种蛋白质，即RNA聚合酶亚单位蛋白（PB1、PB2和PA）、表面糖蛋白血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）、核蛋白（NP）、基质蛋白（M1）、膜蛋白（M2）和非结构蛋白NS1、NS2和PB1-F2，在流感病毒复制中发挥重要作用（见图3）。根据NP和M1抗原决定簇，流感病毒可分为四种类型：甲型流感病毒（IAV）、乙型流感病毒（IBV）、丙型流感病毒（ICV）和丁型流感病毒（IDV）。人类流感主要由甲型和乙型流感病毒引起，根据HA和NA分类系统，有18种HA亚型和11种NA亚型。乙型流感病毒主要分为两个系，即Victoria系和Yamagata系。流感病毒主要通过抗原漂移和抗原转变进行变异，以逃避自然感染和疫苗接种引起的群体免疫。抗原漂移发生在病毒复制过程中出现错误，导致抗原表位发生改变，产生新的病毒亚型，而抗原转变则较少发生，当两种或更多流感病毒感染同一细胞时，病毒基因片段的交换导致子代病毒产生新的亚型组合。病毒的变异导致中和抗体识别表位的构象发生改变，使其能够轻易逃避当前疫苗诱导的特异性免疫，引发每年的季节性流感疫情和全球流感大流行。
现有的流感疫苗保护率仅为40-60%；流感病毒易于变异；当出现与疫苗株不匹配的新流感病毒株时，疫苗的有效性进一步降低。因此，每年需要根据新病毒株更新流感病毒疫苗，然后重新给人群接种，以有效预防流感。流感疫苗的生产过程至少需要6个月，目前大多数已获许可的疫苗是在鸡胚中生产的，这有时会导致病毒的适应性突变，从而降低疫苗效力。因此，开发通用流感疫苗对于预防多种流感病毒株及其引起的全球大流行至关重要。目前，使用病毒亚型间高度保守的病毒蛋白区域作为潜在的靶抗原是开发和设计通用流感疫苗的主要方式，主要靶标包括HA、NA、M2e和NP。
4.1.作为通用疫苗设计的免疫原的血凝素（HA）
血凝素（HA）是流感病毒表面最丰富的糖蛋白，它在病毒入侵和感染过程中起着关键作用。在空间构象上，每个HA单体由两部分组成：球状头部由HA1组成，使病毒能够通过与唾液酸受体结合吸附到宿主细胞上，以及杆状茎部，由HA2和部分HA1组成，锚定在病毒囊膜的脂质双层中。HA头部与细胞表面唾液酸结合后，茎部介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合及病毒囊膜的释放。由于HA头部含有抗原决定簇和受体结合位点，它是疫苗开发的一个重要靶抗原，目前的季节性疫苗也主要触发针对HA头部结构域的抗体；然而，这个位点易于发生抗原漂移和转变，导致疫苗保护有限。高度保守的HA茎部，能够产生中和病毒感染力的保护性抗体而不抑制血凝，是开发通用流感疫苗更具吸引力的靶标。许多研究表明，这个位点包含许多结合广谱中和抗体（bnAbs）的抗原表位，并在抑制病毒进入细胞中发挥重要作用。
HA2区域是通用流感疫苗研究的潜在靶标，但由于HA茎部的抗原表位常被其头部所遮挡，疫苗设计需要增加HA茎部对宿主免疫系统的暴露，例如通过使用茎部结构域中的某些短肽表位与载体蛋白结合，增加HA茎部的免疫暴露，并帮助抗原呈递到茎部的结构域中，从而增强免疫效果。基于流感病毒HA的当前疫苗开发策略可分为无头HA疫苗、嵌合HA疫苗、马赛克HA疫苗和计算优化的广谱反应抗原（COBRA）HA疫苗（见图4）。
4.1.1.无头HA疫苗
一种增加HA茎部免疫优势的策略是完全移除HA头部区域，创建一个“无头”HA结构。无头HA的开发是困难的，因为它不稳定，大多数交叉反应的HA茎部抗体具有构象依赖的表位。例如，Wohlbold等人开发了一种基于HA茎部的抗原，它能够诱导对流感病毒株的保护，但由于缺乏正确的天然茎结构域构象，没有被任何抗体识别。为了解决HA茎表位对天然构象的依赖性，后续研究通过合理设计增强了茎免疫原的结构完整性，以模仿天然的三聚体构象。例如，Corbett等人构建了具有完整结构的HA茎三聚体自组装纳米颗粒，并通过小鼠免疫展示了对致命同型流感病毒攻击的保护；Darricarrère等人在结合AF03佐剂的铁蛋白纳米颗粒上展示了无头HA茎抗原，并在非人灵长类动物中产生了能够中和多种流感病毒株的抗体，表明这些疫苗可以在体内提供广泛的抗流感感染保护。
4.1.2.嵌合HA疫苗
另一种诱导高水平抗茎HA抗体的策略是使用嵌合HA分子（CHAs）进行序贯免疫，这些分子包含相同的HA茎和不同的HA头部，允许诱导的抗体反应主要集中于免疫原性较弱的HA茎。迄今为止，已有几种流感疫苗平台成功地使用嵌合HA分子在动物模型中诱导了HA茎反应性抗体。Liao等人展示了一种单糖基化的CHA疫苗，共享H5作为球状头部和共享H1作为茎，诱导了更多的茎特异性抗体，具有更高的ADCC，更好地中和了研究中的病毒亚型，并对异源流感病毒（包括H1、H3、H5和H7病毒）具有广泛的保护活性。Kotey等人设计了两种主要由H1的保守区域组成的CHA，包括H1/H5 HA和H1/H9 HA，这些疫苗免疫了所有小鼠，使其免受H1病毒的感染，并且免疫小鼠的血清显示出与H5亚型株的交叉反应性。此外，还有已经进入临床试验的CHA，由H8和H5亚型的头部与H1的茎组成，这些疫苗在人类接种后诱导了广泛、强烈和持久的免疫反应。因此，基于上述发现，CHA有潜力被开发成为一种通用疫苗。
4.1.3.马赛克HA疫苗
与改变整个HA头部结构域以产生cHA不同，这些头部中的免疫显性抗原位点应该被其他HA同种型的序列替换，以产生更广泛的保护效力。例如，Sun等人将流感B型病毒HA的主要抗原位点替换为流感A型病毒HA的相应序列，产生了表达为可溶性三聚体蛋白的马赛克HA，并表明该疫苗在小鼠模型中对同源和异源流感B型病毒株具有交叉保护作用；Corder等人设计了一种新的马赛克H1 HA免疫原，涉及多种IAV，小鼠免疫后显示诱导了强烈的抗体反应和细胞免疫，对不同IAV株表现出强烈的交叉保护；Liu等人生产了两种灭活的流感B型病毒马赛克HA疫苗（显示同源或异源HA结构），并表明两种方法都诱导了持久的交叉保护性抗体反应，显示出强烈的ADCC活性，进一步证明了马赛克疫苗作为通用流感疫苗的潜力。
4.1.4.COBRA HA疫苗
最广泛研究的优化HA蛋白，称为计算优化的广泛反应性抗原（COBRA），可以作为重组蛋白或展示在病毒或VLPs的表面，已在包括小鼠、雪貂和非人灵长类动物在内的多种动物模型中显示出诱导多种抗原变异，血清中最常见的血凝抑制反应。Reneer等人构建了H2 COBRA HA疫苗，并在免疫雪貂中测试了其对H2N3攻击的保护，结果表明接种疫苗的雪貂显示出更高的抗体滴度，并在经典中和测定中识别出最多的H2流感病毒，与野生型H2 HA重组蛋白相比；Huang等人使用COBRA方法从2013-2019年流行的H1N1分离株中生成了两种新的候选COBRA HA疫苗，Y2和Y4。接种Y2和Y4的小鼠在感染H1N1流感病毒后有效减少了发病和死亡，并且与2009至2021年的H1N1分离株和类似pdm09病毒相关的疫苗启动抗体产生了高度的交叉反应性，2019-2021年间交叉反应性最强；Allen等人首先用三种历史H3N2菌株感染雪貂，然后使用构建的COBRA或野生型（WT）H3 VLP疫苗抗原测试了扩大的免疫范围，并表明与WT组相比，所有三种历史H3N2菌株的COBRA组产生了更多的交叉反应性抗体，并诱导了能够中和现代漂移H3N2菌株活病毒感染的抗体，滴度更高。
4.2.神经氨酸酶（NA）作为广泛保护的候选免疫原
神经氨酸酶是流感病毒表面另一种主要糖蛋白，通过切割宿主细胞膜上的病毒唾液酸受体，促进病毒颗粒的释放并防止子代病毒在细胞表面的积累，在病毒传播中发挥重要作用。它通常由四个相同的单体非共价结合形成蘑菇状的四聚体，这种结构有助于维持其活性的稳定性。NA可以从N端到C端分为四个主要区域：细胞质、跨膜、茎和头部区域。细胞质区域在序列上高度保守，与病毒组装和出芽有关；跨膜区域与病毒出芽有关；茎区域在序列上高度可变且保守性差，其长度影响神经氨酸酶酶活性；NA头部区域包含NA蛋白抗原决定簇、神经氨酸酶活性中心和糖基化位点。NA蛋白诱导机体产生NA特异性抗体，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）清除，在抑制病毒传播和控制流感感染中发挥重要作用，并且已经证明NA比HA具有更低的抗原漂移频率，相对遗传保守，可以结合同一NA亚型中的抗原保守表位，并可能提供更广泛的保护范围，使其成为通用流感疫苗的理想抗原。
Kim等人构建了一种针对流感病毒H1N1 pdm09的NA VLP疫苗，该疫苗在小鼠免疫后诱导了病毒特异性抗体反应，并产生了对不同流感病毒的交叉保护免疫力，进一步发现用这种疫苗免疫的小鼠的血清在幼鼠中具有交叉保护作用。Strohmeier等人使用了麻疹病毒的磷蛋白四聚体化，并用麻疹病毒磷蛋白的四聚体化结构域替换了NA的细胞质区域、跨膜区域和茎区域，设计了一种重组疫苗，N1-MPP。这种疫苗保留了NA的抗原性、活性和结构完整性，并在小鼠中提供了对致命病毒攻击的强大保护，当与不同配方的季节性疫苗混合时，NA反应减弱，但单独给予时诱导了强烈的抗体反应；因此，这种重组NA疫苗可能增强并放大对季节性流感病毒的保护。此外，Skarlupka等人使用COBRA方法生产了含有四种流感A病毒NA活性的N1疫苗抗原，并且当受到四种流感病毒攻击时，免疫的小鼠免于死亡，肺部病毒滴度低，体重变化很小。因此，疫苗抗原可能成为含有HA抗原的多抗原通用流感病毒疫苗配方的补充成分，并且假设其与HA抗原联合使用可以扩大对各种病毒株的保护。
4.3.膜蛋白(M2)细胞外区(M2e)作为疫苗设计的候选通用免疫原
膜蛋白(M2)是一种由96个氨基酸组成的跨膜蛋白，分为细胞外区、跨膜区和细胞质区，通常以四聚体的形式存在于流感病毒囊膜表面，形成由pH调节的质子选择性离子通道，在低pH的酸性环境中激活，允许质子被泵入病毒颗粒，参与病毒脱落过程。M2蛋白的细胞外区，即M2e，仅包含24个氨基酸残基，暴露在病毒衣壳或感染细胞表面，并与新生病毒颗粒的组装相关。由于M2e在不同毒株和亚型的流感病毒中高度保守，它能诱导交叉保护性免疫反应，因此成为开发通用流感疫苗期间一个有吸引力的靶点。以前的实验已经证明，抗M2e抗体与宿主细胞表面结合的M2e紧密结合，并抑制病毒复制和出芽，从而在动物中产生保护。由于M2e本身免疫原性弱，许多策略被用来增强基于M2e的疫苗的免疫原性。
例如，通过增加疫苗中M2e表位的密度显著提高免疫原性和效力，Krishnavajhala等人在Sindbis病毒上高密度表达M2e肽，并用M2e特异性抗体免疫小鼠，保护它们免受流感A型病毒的致命毒力攻击。此外，他们将多个串联重复的M2e自组装成M2e VLP，然后将其纳入聚合物递送系统AS04并皮下免疫小鼠，显示出免疫潜力。此外，Xu等人将M2e与交叉反应物质(CRM197)结合，合成了一种新型疫苗M2e-CRM197，该疫苗在小鼠免疫后诱导抗M2e抗体，并且诱导效率比单独M2e组高，显示出更高的免疫原性。INGROLE等人将M2e与金纳米颗粒(AuNPs)结合，并添加TLR9激动剂CpG作为佐剂，开发了一种广泛保护的流感A型疫苗。这些基于流感M2e表位的疫苗设计为流感通用疫苗的开发显示出希望。
4.4.核蛋白(NP)作为通用疫苗的保守免疫原
核蛋白(NP)是核衣壳的主要成分，与病毒基因组RNA和病毒聚合酶形成核糖核蛋白复合物(RNPs)，参与病毒的转录、复制和组装。NP是流感病毒的内部蛋白，能在宿主中诱导产生非中和抗体，并且是细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)识别的主要抗原。CTLs通过识别感染细胞表面由MHC I类分子呈现的流感病毒NP的抗原肽，发挥细胞毒性作用，从而从感染宿主细胞中清除流感病毒。由于NP基因高度保守，其诱导的CTL反应能产生对同源和不同亚型病毒株的交叉反应，诱导更广泛、更持久的保护性免疫。因此，流感病毒NP也作为下一代替代疫苗靶标引起了极大关注。例如，Lee等人准备了两种带有NP的重组腺病毒载体疫苗，测试流感B型病毒两个抗原系的NP表位变化是否影响疫苗接种诱导的主要CTL反应和保护性免疫，发现两种疫苗均能在小鼠鼻腔免疫后诱导强烈的交叉反应性CTL，即使CTL表位发生变化，也仍然具有交叉保护性，表明NP是一个保守的通用疫苗靶标。此外，通过融合流感A型病毒NP的七聚体结构域DNA序列和OVX313，得到了一种重组蛋白疫苗OVX836，Campo等人先前已证明其对流感病毒具有广谱保护作用。后来的实验表明，与形成单体和三聚体结构的突变型NP(NPm)和野生型NP(NPwt)相比，OVX836在免疫上诱导了更多的具有NP特异性IFN-γ介导保护的不同流感亚型CD8+ T细胞，目前正在进行临床I期试验。它显示出高度的免疫原性和安全性，进一步证明NP是通用疫苗的可行候选靶标。
5.广谱流感疫苗的设计
当前通用流感疫苗的基本要求是至少有75%的保护率，以抵御由流感A型和B型病毒引起的流感症状，并且疫苗应在所有年龄组中至少有效一年。HA、NA、M2e和NP作为疫苗免疫原具有不同的优势，可以诱导互补的免疫反应。随着对流感病毒抗原的深入研究，已经提出了几种疫苗设计策略。
5.1.串联蛋白免疫
广谱流感疫苗设计的基本方法是将不同保守表位的病毒蛋白串联或融合表达，这不仅提高了疫苗效力，而且与针对病毒单一抗原肽的疫苗相比，还减少了生产时间和成本。一些相关研究可供参考；例如，Golchin等人设计并合成了串联抗原蛋白M2e-HA2，在小鼠免疫后显著诱导了对流感病毒的体液免疫反应，病毒挑战证明串联蛋白保护小鼠免受H9N2流感病毒的侵害。Farahmand等人设计了一种由三个串联重复的M2e氨基酸序列与利什曼原虫HSP70基因融合的串联蛋白3M2e-HSP，小鼠体内初步实验表明3M2e-HSP嵌合蛋白刺激了特异性免疫反应，并诱导了淋巴细胞增殖和IFN-γ分泌，保护小鼠免受致命流感挑战。Kwak等人生产了一种3M2e-3HA2-NP融合蛋白，在免疫小鼠后完全保护其免受H1N1病毒侵害，诱导强烈的病毒特异性抗体反应、细胞毒性T细胞活性和抗体依赖性细胞活性，并且当与聚γ-谷氨酸和氢氧化铝(PGA/alum)复合物佐剂一起使用时，小鼠表现出更高的交叉保护；这些结果表明，串联蛋白免疫是广谱流感疫苗设计可行的方法。然而，疫苗目前的免疫原性差，诱导的免疫反应弱，通常需要多次接种才能获得保护性免疫，并且生产速度相对较慢。
5.2.纳米颗粒展示
使用纳米平台传递相关抗原是开发新型流感疫苗的有前途的方法。纳米颗粒中抗原的高密度和结构有序促进了B细胞受体对抗原的识别，并触发了有效的细胞和体液免疫反应。此外，纳米颗粒已被证明可以保护抗原免受蛋白水解降解，改善抗原传递，并延长抗原呈递细胞(APCs)的抗原呈递。例如，Wei等人使用载有内部包裹的NP蛋白和表面偶联的HA蛋白的载铁蛋白(AFt)纳米笼作为载体，构建了一种仿生流感疫苗，在小鼠免疫后产生了HA和NP特异性抗体，并在同源和异源病毒的致命感染中提供了完全保护，这种仿生疫苗表明了疫苗开发策略。Ma等人构建了具有HA或M2e外壳和NP核心的双层蛋白纳米颗粒，并用它们免疫小鼠，发现疫苗显著增加了M2e特异性血清抗体效力，并增强了伴随的ADCC反应，诱导了更强的NP特异性T细胞反应和HA中和，并保护小鼠不仅免受同源病毒侵害，还免受异源和异亚型流感病毒的侵害。Qiao等人将H3N2病毒HA干的A螺旋(Ah)和CD螺旋(CDh)与单独或串联的铁蛋白融合，生产了Ah-f、CDh-f和(A + CD)h-f纳米颗粒。在小鼠皮下免疫三次后，发现CDh-f和(A + CD)h-f诱导了强大的体液和细胞免疫反应，并在H3N2病毒的致命攻击中提供了完全保护。Boyoglu-Barnum等人通过计算设计构建了一种由20个HA三聚体有序排列的两组分纳米颗粒免疫原，体外组装能够精确控制多种不同HA的共展示比例。例如，当用于展示市场上四价流感疫苗(QIV)的四种流感病毒亚型HA时，触发与疫苗匹配的菌株的抗体反应相当于或优于商业QIV，同时通过靶向HA茎部对异源病毒诱导广泛保护性抗体反应，这些结果表明，基于纳米颗粒的抗原展示平台是对抗流感的有希望的疫苗平台。缺点是纳米颗粒的大小无法准确控制。一些数据显示，较大的纳米颗粒可以被APC更有效地识别，并更强烈地激活T细胞，但也具有良好的淋巴循环。此外，抗原的选择并且要考虑抗原之间的距离：不同的抗原带来不同的免疫原性，是疫苗产品的重要选择。抗原的数量及它们的密度也与疫苗的有效性密切相关。可用数据表明更多抗原和更致密的抗原可以更强烈地激活 B 细胞，但同时，过大的密度会影响抗原结合的有效性;所以，确实如此在数量和距离之间找到最佳平衡的必要性。
5.3.类病毒颗粒(VLPs)组合疫苗
VLPs是通过将编码病毒结构蛋白的基因插入质粒载体，然后转化或转染到目标表达系统中产生的。由于产生的VLPs不包含病毒核酸，因此它们不具有传染性或致病性，具有强大的免疫原性，并且能在体内激发强烈的体液和细胞免疫反应。通常选择昆虫细胞-杆状病毒表达系统来生产流感VLPs，产生的VLPs在形态上与天然流感病毒相似。例如，张等人通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统准备了含有H3N8马流感病毒(EIV)HA、NA和M1蛋白的VLPs，用VLPs免疫马产生的高免血清注射到小鼠体内，然后进行挑战，表明马高免血清对H3N8 EIV感染具有良好的预防和治疗效果。李和胡等人使用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建了含有HA、NA和M1的H7N9 VLP疫苗候选物，通过肌肉注射免疫后，激发了强烈的抗体免疫反应，保护鸡和小鼠免受致命的H7N9病毒攻击，而这些H7N9 VLPs诱导的抗体显示出良好的交叉反应性。Keshavarz等人通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统准备了含有H1、N1和M1抗原的H1N1 VLPs，并通过肌肉(IM)或鼻腔(IN)途径注射到小鼠体内，结果产生了强大的T细胞免疫。这些实验结果突出了基于昆虫细胞-杆状病毒表达系统的VLP疫苗的巨大潜力和可行性。然而，存在局限性，即杆状病毒颗粒和VLPs难以分离，并且使用该系统大规模生产VLPs疫苗存在挑战。此外，Wei等人提出了一种基于乙型肝炎病毒核心病毒样颗粒(HBc VLP)的流感疫苗设计策略，通过遗传融合在HBc VLP外表面展示M2e抗原，内部包裹NP抗原，构建了内部NP/外部M2e的仿生双抗原流感疫苗。通过小鼠腹腔内免疫，疫苗诱导产生了NP和M2e特异性抗体，并完全保护小鼠免受致命的H1N1流感病毒侵害，而无显著体重损失，而非仿生双抗原疫苗仅提供了62.5%的保护和12.5%的体重损失，这一结果表明基于HBc VLP的流感疫苗设计策略也具有未来发展潜力。尽管当前研究已证实VLPs可用作有效的流感疫苗，但其生产仍存在一些技术困难，如流感VLPs的组装通常需要几种蛋白，重组载体表达不同蛋白进入同一细胞的概率小，降低了蛋白间相互作用和VLPs组装的机会，构建多基因共表达载体的困难，同一载体上每个基因的表达比例不易控制。此外，VLPs的形成可能受到构建多基因共表达载体的困难和同一载体上每个基因表达比例控制的困难的影响，以及如何有效扩大工艺、提高VLPs组装效率和降低成本的挑战。
5.4.DNA疫苗
DNA疫苗是一种使用重组技术将目标基因克隆到真核表达载体中并将其引入体内以表达相应抗原并诱导保护性免疫反应的疫苗，用于预防和治疗。现有的基于DNA的抗原传递平台包括细菌质粒、重组病毒载体和细菌载体。虽然传统的流感疫苗倾向于诱导依赖于有机体的免疫并缺乏T细胞免疫，但使用流感病毒内部蛋白保守表位开发的DNA疫苗倾向于诱导T细胞反应，并在抑制病毒传播和清除感染细胞、促进更广泛的交叉保护方面发挥重要作用。此外，重组DNA分子可以同时编码多个目标基因片段，并在细胞水平高度表达目标蛋白，这不仅可以在一定程度上降低疫苗的生产成本，还可以刺激体液和细胞免疫反应。然而，DNA疫苗的免疫原性和保护效力较低，需要设计优化的抗原序列或外源性修饰来改善。例如，Guilfoyle等人设计了一种多价流感DNA疫苗，编码H1N1(2009)和H3N2(1968)株的HA和NA，以及H1N1(1918)株的NP、M1和M2。用这种DNA疫苗免疫雪貂，不仅保护它们免受H1N1 pdm09的同源攻击，还保护它们免受异源流感病毒H5N1的侵害，证明了这种DNA疫苗对异源病毒的有效性。以M2e为靶点抗原，姚等人构建了两种DNA疫苗，p-tPA-p3M2e增加了抗原表位密度，p-p3M2e增强了抗原分泌。结果表明，两种疫苗均在小鼠体内诱导了高M2e特异性体液和细胞免疫反应，p-tPA-p3M2e对同一亚型H1N1病毒的致命攻击提供了更有效的保护，并显示出对不同亚型(H9N2、H6N6和H10N8)的交叉保护。此外，Qiao等人设计了一种名为HA-F的DNA疫苗，将流感病毒HA与自组装铁蛋白纳米颗粒融合，用这种DNA疫苗免疫小鼠三次，每次100 µg，显示出显著的HA特异性体液和T细胞免疫反应，并保护小鼠免受同源H1N1病毒的致命感染，表明HA-F是一个有竞争力的疫苗候选物。总之，DNA疫苗有望发展为通用、广谱的流感病毒疫苗。目前，DNA疫苗的主要给药方式仍然是肌肉内注射，这使得疫苗难以穿过细胞膜，只有少量到达抗原呈递细胞并引发免疫反应。此外，尽管在小鼠等动物模型中已实现了良好的免疫保护，但在大动物和人类中观察到的降低的效力阻碍了临床应用的进展，预防性DNA疫苗的大规模使用引发了一些安全问题，最引人注目的可能是整合到宿主基因组、抗生素抗性和DNA靶向自身免疫的潜力。
5.5.mRNA疫苗
mRNA疫苗是通过将编码抗原蛋白的mRNA引入体内，转录并翻译以产生相应的抗原蛋白并诱导特异性免疫反应。例如，Zhuang等人构建了H1N1-HA mRNA疫苗，并通过鼻腔给药免疫小鼠，表明mRNA疫苗激发了体液和细胞免疫反应，并保护小鼠免受致命流感病毒的侵害。Freyn等人设计了一种编码多种抗原蛋白（HA茎部、NA、M2e和NP）的mRNA，并使用核苷修饰和LNP封装，通过皮下免疫小鼠，结果产生了广泛且强大的免疫反应。接种这种疫苗后获得的血清抗体能够结合多种流感病毒株，证明了核苷修饰的mRNA-LNP疫苗表达多种保守抗原作为通用流感病毒疫苗候选物的有效性。Chivukula等人证明了使用多种流感抗原的mRNA疫苗作为单价或多价疫苗的适用性，HA和NA mRNA-LNP制剂在非人灵长类动物中诱导了强大的功能性抗体和细胞反应。此外，他们证明了共同封装和组合的多价疫苗（HA/NA mRNA-LNPs）可以有效递送所有抗原而无免疫干扰，且所有抗原在单独递送时均具有免疫原性，支持使用mRNA多价疫苗生产快速大流行或季节性流感病毒疫苗。在小鼠、雪貂和猪中测试了几种IAV亚型的体外合成mRNA疫苗，这些疫苗已被证明具有免疫原性和安全性。非人灵长类动物对脂质纳米颗粒递送的mRNA疫苗反应良好，显示出持续的体液免疫反应。在过去十年中，mRNA疫苗的生产和递送技术已显著改进，有可能设计和开发通用流感mRNA疫苗。然而，mRNA极其不稳定，易受环境降解，mRNA疫苗需要在-80°C下储存，这使得维持冷链极其困难。需要开发更安全、更有效且无需冷链的mRNA疫苗，例如开发耐热mRNA疫苗。对mRNA疫苗在体内的作用机制还需要进一步研究，特别是在研究各自mRNA、递送系统和特定目标细胞或器官对先天免疫反应的影响，以最小化潜在副作用。
5.6.亚单位疫苗
亚单位疫苗是基于裂解病毒疫苗进一步纯化的抗原组分，具有更高的安全性，但免疫原性较低。通常通过添加适当的佐剂、融合多种病毒蛋白和改变疫苗接种策略来提高免疫原性。例如，Saleh等人评估了流感病毒H1N1亚单位疫苗（3M2e-HA2-NP）在小鼠模型中的免疫原性和保护特性，发现接种这种亚单位疫苗的小鼠产生了特异性抗体反应，并刺激细胞因子产生记忆CD4细胞和Th1及Th2细胞，显示出75%的保护率，以抵御流感病毒的致命攻击。通过将流感病毒H7N9亚型HA蛋白和M2e蛋白的高度保守抗原区域与CTxB（霍乱毒素B亚单位）作为佐剂融合，Jafari等人形成了M2e-Linker-CTxB-Linker-HA2嵌合疫苗，生物信息学分析表明，嵌合疫苗保留了病毒抗原结构和抗原性，具有高稳定性和长半衰期。Sharma等人设计了一种基于流感病毒HA、NP和M1的高度保守表位序列的通用流感亚单位疫苗，旨在包括2个肽佐剂、26个CTL表位、9个HTL表位和7个线性BCL表位，以诱导针对流感A病毒的先天、细胞和体液免疫反应。预计亚单位疫苗具有稳定的结构，分子动力学模拟表明，疫苗的免疫原性为抵御多种流感A病毒亚型提供保护。上述结果强烈表明，亚单位疫苗可能继续作为有前途的流感病毒疫苗候选物进行开发。该疫苗的缺点是通常无法诱导有效的细胞介导反应，特别是由CD8+ T细胞介导的反应，已有研究表明，这些反应与流感病毒感染后的更好预后相关。这些反应在显著降低病毒载量和改善疾病严重程度方面发挥重要作用。
总体而言，在上述疫苗开发策略中，mRNA疫苗最有前景，原因如下：首先，mRNA疫苗开发周期短，可以根据病毒的基因序列迅速开发。其次，mRNA疫苗具有体液和T细胞免疫的双重作用机制。过去的传统疫苗侧重于诱导体液免疫，而mRNA疫苗同时产生体液和细胞免疫，刺激T细胞以防止病毒入侵和增殖。第三，mRNA疫苗具有免疫原性，不需要佐剂效果，避免了佐剂可能引起的免疫副作用。第四，mRNA疫苗不携带病毒成分，没有感染风险，并通过正常的细胞过程降解，使其安全。最后，mRNA疫苗技术生产过程简单，易于大规模生产，并支持全球供应的目标。
6.结论
流感继续对公共卫生构成重大威胁，疫苗接种是目前最有效的对抗措施。尽管中国目前有几家流感疫苗制造商，但产品组成同质化，主要由在鸡胚中生产的裂解疫苗组成。除了生产时间长之外，另一个缺点是可能会发生适应性突变，从而改变流感疫苗的保护效果。基于MDCK细胞的流感疫苗可以预防这个问题，尽管这些基于细胞系的疫苗在中国目前还处于起步阶段。此外，中国的疫苗接种率与发达国家相比较低。影响疫苗接种率的因素很多，包括疫苗政策、疫苗接种历史以及对流感和疫苗的知识和态度。为了解决这些因素，需要提出措施来提高疫苗接种覆盖率。此外，考虑到当前全球COVID-19大流行，另一场流感疫情的发生将产生大量具有类似呼吸道感染症状的病例，从而增加了COVID-19鉴别诊断的复杂性。这可能导致一些COVID-19病例难以及时检测和管理，可能加剧SARS-CoV-2的传播风险，并带来更严重的健康影响。
为了更好地控制季节性流感和可能的未来流感大流行，迫切需要设计和开发一种能够应对所有类型和亚型的流感病毒并产生持久免疫力的通用流感疫苗。近年来，在通用流感疫苗的开发方面取得了许多重要进展，几种基于不同靶标和形式的广谱流感疫苗已在动物模型中成功验证。一些疫苗候选物已进入临床阶段，并显示出良好的免疫原性和安全性，但尚未有通用流感疫苗获批上市，这可能与流感病毒类型的多样性和持续变异以及疫苗的最终效力有关。这可能影响持续保护，以及质量监控、市场监管和相关政策的问题。
