摘要：灭活疫苗和减毒活疫苗是预防家禽病毒性疾病的主要手段。然而，近年来重组 DNA 技术的发展使得重组病毒载体疫苗的生成成为可能，这些疫苗具有同时预防多种疾病和简化疫苗接种计划的优势。更重要的是，有些疫苗能够在母源抗体存在的情况下诱导保护性免疫反应，并提供长期免疫保护。这些优势弥补了传统疫苗的不足。本综述描述了主要家禽疫苗载体的构建和特性，包括鸡痘病毒（FPV）、鸡腺病毒（FAdV）、新城疫病毒（NDV）、马立克病病毒（MDV）和火鸡疱疹病毒（HVT）。此外，还介绍了不同家禽重组病毒载体疫苗针对的病原体及其免疫保护效果。最后，本综述讨论了开发载体疫苗的挑战，并提出了提高免疫效果的策略。
1. 引言
目前，疫苗接种和生物安全措施是控制家禽疾病传播的主要方法。在现有的各种疫苗类型中，灭活疫苗和减毒活疫苗已被广泛使用。随着重组技术和反向遗传技术的进步，已开发出重组病毒载体疫苗，这些疫苗展现出许多独特的优势，并逐渐成为与传统疫苗相比更受欢迎的选择（表 1）。重组病毒载体疫苗是通过将一个或多个外源基因，如传染性法氏囊病病毒（IBDV）的病毒蛋白 2（VP2）基因、禽流感病毒（AIV）的血凝素（HA）基因、新城疫病毒（NDV）的融合（F）基因或鸡腺病毒（FAdV）的纤维基因，整合到活病毒的非必需区域中，使用活病毒作为载体。由于外源蛋白可以在宿主中持续表达，这些疫苗可以提供延长的免疫保护，并诱导特异性的细胞和体液免疫反应。更重要的是，一些病毒，如火鸡疱疹病毒（HVT），克服了由母源抗体引起的干扰。此外，这类疫苗不会引起不良反应，显示出最小限度的毒力回复风险和令人满意的遗传稳定性，并且具有低水平的水平传播潜力。此外，这些重组疫苗可以通过皮下注射在 1 日龄或胚胎内轻松接种。此外，重组和反向遗传技术的持续进步使得重组病毒的快速生成成为可能，如在短时间内几周内创建重组 NDV。这些优势促进了重组病毒载体疫苗的逐渐采用和应用。此外，腺病毒、疱疹病毒和痘病毒也已被广泛使用。自 21 世纪初以来，已商业化了众多病毒载体疫苗，如 Trovac®-NDV、Trovac® AI H5、Vectormune® FP LT、Newxxitek™ HVT + ND、VAXXITEK® HVT + IBD + ILT 和 Innovax® ND-IBD。本文主要描述家禽病毒载体疫苗的构建和特性、针对的病原体以及免疫保护效果。此外，我们讨论了开发载体疫苗的挑战，并提出了免疫效果策略。
2.各种重要的病毒载体
2.1.马立克病病毒和火鸡疱疹病毒
由 MDV 引起的马立克病（MD）特征为高度传染性的免疫抑制、恶性 T 细胞性淋巴瘤的发生以及鸡的神经系统疾病。目前，已鉴定出三种血清型，即 MDV 血清型 1（MDV-1）、MDV 血清型 2（MDV-2）和 MDV 血清型 3（MDV-3），也分别称为 Mardivirus gallidalpha2、Mardivirus gallidalpha3 和 Mardivirus meleagridalpha1，它们属于 Orthoherpesviridae 科、Alphaherpesvirinae 亚科、Mardivirus 属。MDV-1 包括肿瘤病毒株及其减毒变体。另外两个物种，MDV-2 和 MDV-3，分别是从鸡和火鸡中分离出来的非肿瘤性病毒。后者也被称为 HVT。最近，利用减毒 MDV-1 或 HVT 的重组病毒载体疫苗的应用引起了极大关注，因为它能够规避母源抗体的干扰，诱导持久感染以实现终身免疫，并作为开发多价疫苗的有效平台，简化了疫苗接种计划。此外，基于 HVT 的疫苗与其他病毒载体相比具有独特的优势：天然无致病性，使其比减毒 MDV-1 更安全（表 2）。MDV-1、MDV-2 和 HVT 的基因组是大约 178 kbp 的双链 DNA，由独特的长（UL）段和独特的短（US）段组成，分别由末端和内部重复长（TRL 和 IRL）和末端和内部重复短（TRS 和 IRS）所环绕。基因组中大约六个常用于病毒复制的非必需区域为外源表达盒提供了插入位点，包括 HVT 基因组的 US2 和 US10 基因、UL45-UL46、HVT005-HVT006、HVT065-HVT066 和 SORF3-US2 基因间区，以及 MDV-1 基因组的 US2 和 UL41 基因。产生重组 MDV-1 和 HVT 的策略可能涉及利用细菌人工染色体（BACs）和同源定向修复（HDR）依赖的 CRISPR/Cas9 或 fosmids。每种策略根据其特点都有独特的优势。在 CRISPR/Cas9 系统中，需要一个携带上游和下游同源臂的表达盒的质粒，通过 HDR 依赖的 CRISPR/Cas9 策略共转染一个携带 sgRNA 和 Cas9 基因的市售质粒进入细胞，然后用 HVT 或 MDV 感染。当出现细胞病变效应时，可以通过斑点纯化获得重组病毒。近年来，Cre-loxP 系统结合 NHEJ 依赖的 CRISPR/Cas9 也被应用于挽救重组病毒。这种方法之所以被利用，是因为 NHEJ 在引入外源基因方面的效率更高，因为 NHEJ 可以在整个细胞周期中发生。相比之下，HDR 限于 S 和 G2 阶段。此外，Cre-LoxP 技术的引入使得更便于精确地切除报告基因。CRISPR/Cas9 或 Cre-LoxP 系统的方法都不需要构建 HVT 的反向遗传系统，这看起来方便，但斑点纯化的过程很费时，可能需要几周甚至几个月。此外，当 HVT 传代时，基因组可能会发生突变。因此，许多学者尝试构建 HVT 的反向遗传系统，尽管很难生成。对于 BAC 系统，可以通过同源重组将 BAC 载体序列插入基因组的非必需复制区域，然后在滚环复制阶段提取环状 DNA（图 1）。BAC 策略的一个显著优势是，可以通过将重组体转化到大肠杆菌中，在细菌中轻松操作病毒基因组。不同的重组病毒可以以高通量的方式在几周内产生。然而，需要注意的是，病毒基因组中的 BAC 载体序列可能会导致重组病毒的特征改变。它可以选择性地被 CRISPR/Cas9 系统敲除，或者可以通过使用 fosmid 策略来克服，在转染前使用限制性酶切除。然而，BAC 和 fosmid 策略必须避免构建携带病毒基因组的质粒的繁琐步骤。最近几个月，基于酿酒酵母中的单步转化相关重组（STAR）的简单、快速和高效方法被用于生成完整的 β-疱疹病毒和 γ-疱疹病毒基因组。方便的是，线性病毒基因组可以直接整合到包含酵母着丝粒质粒和 BAC 复制子的载体中，避免了生成携带病毒基因组的质粒的繁琐步骤。目前，还没有相关报告表明这种方法被应用于 HVT 或 MDV 的反向遗传系统。然而，这种方法无疑为构建大基因组 DNA 病毒的反向遗传系统提供了新的方向。从理论上讲，破解感染细胞，通过超速离心获取病毒粒子，然后提取完整的病毒 DNA，最终通过 STAR 系统与 BAC 质粒连接，可能快速获得完整的 HVT 或 MDV 基因组的克隆。
评估疫苗的有效性一贯基于免疫保护的水平。无数研究表明，疫苗提供的免疫保护主要受插入位点和启动子的影响，这两者都影响外源蛋白的表达水平。Gao 等人证明，将携带 HA 基因的表达盒插入 US2 和 US10 基因，产生的重组病毒展现出不同的生物学特性，如斑块形态和大小、生长动力学（54 小时内 rHVT-US10-HA 的生长高于 rHVT-US2-HA，但 54 小时后低于 rHVT-US2-HA），以及保护效果（由 rHVT-US10-HA 诱导的抗体滴度低于 rHVT-US2-HA，可能诱发更好的免疫保护）。同样，Zai 等人的研究证实，不同的插入位点可能影响外源蛋白的表达，从而影响免疫保护效果。在 MDV 中，Zhang 等人的工作揭示了重组 MDV 在不同的位点对 H9N2 AIV HA 基因表达盒显示出不同的转录活性。转录活性的差异可能导致不同的蛋白表达水平，从而影响免疫保护效果。CMV、Pec（CMV/β-actin 嵌合启动子）、EF1α、CAG 和 SV40 是外源表达盒中常用的启动子。Tsukamoto 等人分别使用 CMV 和 Pec 启动子构建了两个表达 IBDV VP2 蛋白的 HVT 重组体，并发现 rHVT-pecVP2 在体外表达 VP2 抗原的水平大约是 rHVT-cmvVP2 的四倍。此外，蛋白表达水平、抗体水平和免疫保护效果之间存在正相关。同样，Li 等人揭示了在 Pec 启动子下表达 IBDV VP2 蛋白的 MDV 重组体的蛋白表达、抗体水平和免疫保护高于同等重组体在 CMV 启动子下的表达。这些结果支持了更高蛋白表达水平导致增强免疫保护的结论。然而，根据 Sonoda 等人的实验发现，尽管在 simian virus 40 晚期启动子控制下表达 NDV F 蛋白的重组 MDV-1 [rMDV1-US10L(F)] 的蛋白表达水平显著高于使用 MDV1 糖蛋白 B (gB) 启动子的 [rMDV1-US10P(F)]，但 rMDV1-US10P(F) 在已有母源抗体的商业鸡中诱导了对 NDV-F 和 MDV1 抗原更快更强的抗体反应，与 rMDV1-US10L(F) 相比。此外，将 rMDV1-US10P(F) 给已有母源抗体的商业鸡接种可完全保护其免受 NDV 挑战。此外，在重组 MDV 中评估了五个不同启动子的转录活性和保护效果，包括三个 MDV 内源启动子[特别是 gB 基因的启动子、pp38 的双向启动子 (ppp38) 和 1.8 kb RNA 转录本的启动子 (p1.8 kb)]，以及 CMV 和 SV40 启动子，所有这些都控制 H9N2 的 HA 基因。发现揭示了 gB 基因启动子和 ppp38 显示出显著较低的转录活性，特别是 ppp38 启动子，它提供了 50% 的保护，而 gB 启动子提供了 25% 的保护。相反，其余三个启动子表现出相对较高的转录活性并没有引起任何免疫保护效果。总之，某些抗原的表达与免疫效果之间没有直接相关性，这可能归因于过量的蛋白表达超过了抗体产生的最优浓度，导致效率降低。或者，高水平的表达可能触发过度的免疫反应，抑制重组病毒在宿主中的生长，最终损害免疫保护。这些发现表明筛选启动子对于实现改进的免疫保护至关重要。
由于其良好的安全特性和方便的免疫途径（胚胎内），基于 HVT 的疫苗在表达不同禽类病原体的保护性抗原方面已获得显著普及。目前，与其他病毒载体疫苗相比，HVT 具有最佳的商业可行性。迄今为止，已有十多种基于 HVT 的疫苗商业化，包括 VAXXITEK® HVT + IBD、Newxxitek™ HVT + ND、Vectormune® HVT ND、Vectormune® AI H5、Vectormune® AI H7、Innovax® ND 和 Procerta® HVT-ND。然而，必须强调的是，不推荐在同一只鸟上接种两种不同的 rHVT 疫苗，因为复制速度更快的病毒产生的免疫反应可以中和复制速度较慢的病毒，这可能显著损害两种疫苗的有效性。因此，已经开发了表达多种抗原的商业 rHVT 疫苗，包括 Innovax® ND-ILT、VAXXITEK® HVT + IBD + ILT、VAXXITEK® HVT + IBD + ND、Ultifend® IBD ND 和 Innovax® ND-IBD。这些双重插入活疫苗已优化，以提供针对多种病原体的有效免疫保护。例如，Innovax® ND-IBD 可以提供 8 周的免疫持续时间对抗 ND 和 IBD，以及整个风险期的免疫持续时间对抗 MD。Ultifend® IBD ND 可以为肉鸡提供 9 周的免疫持续时间对抗 ND（蛋鸡为 18 周）和 IBD。
除了商业疫苗外，在过去十年中，许多携带不同外源蛋白的重组 HVT 或 MDV，如 IBDV 的 VP2 蛋白、流感 HA、C. psittaci 的 PmpD 蛋白、NDV 的 F 蛋白和 ILTV 的 gD 和 gI 蛋白，已评估其免疫保护效果（表 3）。与 MDV 相比，使用 HVT 作为载体开发重组疫苗受到了更大的重视，这可能归因于 rHVT 的安全特性。然而，由于 MDV 向更高毒力的持续进化，它在预防非常毒力 (vv) 和非常毒力加 (vv+) MDV 菌株方面变得不那么有效。这种缺点可以通过与 HVT 和 MDV-2 联合免疫或使用 MDV-1 疫苗来克服。此外，已证明 rHVT 和 rMDV 联合免疫，表达不同外源基因，可提供有效的免疫保护。研究表明，HVT 疫苗表达 NDV 抗原和 MDV 1 型 Rispens 病毒表达 IBDV 抗原的组合，分别对 MDV、IBDV 或 NDV 挑战提供了 94%、100% 或 94% 的保护，没有任何显著的干扰。或者，用含有 chIFN-γ 或 chIL-17A 的质粒接种 HVT 已被证明可以增强对 vv MDV 菌株的保护效果。事实上，当前的 MD 疫苗没有引起灭菌免疫或有效抑制挑战病毒的携带。允许宿主存活但不防止病原体传播的疫苗将允许 vv 菌株的出现和持续存在。这种类型的疫苗通常被称为泄漏疫苗。Gandon 等人证明，部分抑制病毒生长的疫苗可能会在野生型病原体中引起异常高水平的进化变化。这种类型的疫苗可能只提供临时解决方案。因此，开发能够有效阻断排放的MD疫苗应该是主要关注点。
2.2.禽痘病毒
禽痘病毒具有携带大型外源基因的能力，这使得基于痘病毒的载体系统成为疫苗开发中广泛应用的平台。这些系统已被广泛利用，用于制定重组疫苗，编码各种抗原，以减轻人类和动物群体中疾病的发生，特别是天花病毒，它已被评估对各种病毒的有效性，例如登革热病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒和流感A病毒。基本的天花病毒载体技术已扩展到痘病毒家族的其他成员，特别是禽痘病毒（FPV），它被针对家禽工业中的物种特异性应用进行了靶向。根据国际病毒分类委员会（ICTV）发布的最新分类结果，FPV以及属于Chordopoxvirinae亚科的Avipoxvirus属的金丝雀痘病毒、鸽痘病毒、鹦鹉痘病毒等，是大型的、有包膜的、砖形的DNA病毒，基因组约为300 kb。
基于Avipoxvirus的载体系统具有几个显著特点。首先，由于痘病毒的高保真度DNA聚合酶，它们在遗传上稳定，与其他病毒相比具有低的核苷酸突变率。其次，大型基因组包含几个对病毒复制非必需的区域，允许整合多个外源基因，这使得多价疫苗的开发成为可能。然而，需要注意的是，病毒的复制和蛋白质的翻译是由痘病毒编码的酶完成的，独立于宿主细胞酶。因此，外源基因的转录必须使用痘病毒启动子。第三，痘病毒在细胞质的局限范围内实施其复制过程，从而避免了与其宿主生物基因重组的固有风险。第四，痘病毒在哺乳动物宿主中引起的感染具有暂时性，排除了传播给其他动物或扩散到周围环境的可能性（表2）。在制造重组FPV的遗传工程中使用的方法主要采用同源重组过程将外源基因整合到载体基因组中。具体来说，这些外源基因的表达盒通过转移质粒传递。该质粒携带与载体基因组内目标位点互补的序列，通过同源重组完成表达盒的插入（图1）。此外，CRISPR/Cas9系统已被用于工程化正痘病毒和金丝雀痘病毒。然而，这一系统尚未应用于FPV。
据我们所知，第一种用于预防家禽病毒病的重组FPV是在20世纪80年代通过将H5N8株的HA基因插入FPV株FP-1基因组中开发的，它为同源（H5N8）和异源（H5N2）流感病毒提供了完全保护。这一重要成就之后，几种重组痘病毒疫苗在不同国家获得了许可，包括Trovac®-NDV、Trovac® AI H5、Trovac® Prime H7（Boehringer Ingelheim Animal Health）、Vectormune® FP ND和Vectormune® FP-LT（Ceva Animal Health）。Trovac®-NDV能够通过一次剂量在无特定病原体（SPF）鸡中诱导高水平的抗体，并在8周内维持，可以保护免受致命的肌肉内NDV挑战和FPV挑战，即使在存在母体抗体的情况下。这种疫苗已获准通过皮下途径在一天大时接种。
尽管如此，它在现场应用中的采用仍然有限。此外，为了保护免受H5亚型流感病毒的侵害，Boehringer的另一种疫苗，称为“Trovac® AI H5”，在1998年在美国获得了紧急授权。随后，它在许多国家获得了完全注册。Trovac® AI H5疫苗对死亡率（90-100%）、发病率（90-100%）以及高致病性禽流感（HPAI）墨西哥H5N2分离株的肛门和呼吸道排毒提供了保护。此外，Trovac® AI H5的有效性已针对各种HPAI分离株进行了评估。它在暴露于九种不同的HPAI H5病毒后，对临床症状和死亡率提供了全面保护。这些病毒在38年的收集过程中，与疫苗中的HA蛋白的序列相似性为87.3-100%。对禽痘和AIV的母体免疫以及母体抗体的存在，并没有显著阻碍一天大的后代用Trovac® AI H5疫苗接种后免疫的诱导。作为二次免疫接种在主要控制FPV疫苗FP-C接种后的HPAI病毒挑战中提供的保护显示出不一致性。预先存在的免疫可能会抑制活疫苗启动感染，随后阻碍成功建立免疫反应；然而，两种疫苗都保护免受致病性禽痘的挑战。因此，不推荐在以前接种过或感染过禽痘的鸟类中使用该疫苗。这是在家禽中使用重组FPV（rFPV）的限制之一。另一个限制是疫苗和FPV的田间菌株可以与网状内皮增生症病毒（REV）的长末端重复序列或近乎完整的REV基因组整合。以前的研究表明，FPV疫苗污染REV导致接种的鸟类出现肿瘤，几乎完整的整合REV原病毒可能会产生传染性REV，从而可能导致免疫抑制，从而增加致病性。然而，涉及的机制尚未完全阐明。FPV疫苗污染禽白血病病毒（ALV）也被认为是一个严重的问题。对中国2010年之前生产的不同批次的减毒疫苗的回顾性调查显示，三种与同期在中国分离的野生ALV-A菌株具有最高同源性（97.7%）的ALV菌株分别成功地从三种减毒疫苗中分离出来，包括一种活FPV疫苗、一种活NDV疫苗和一种活IBDV疫苗。同样，在尼日利亚商业化的FPV疫苗中通过PCR检测到了ALV-J的核酸。这种现象表明，ALV可以通过接种活疫苗感染鸡，这要求我们采取严格的检测措施，在所有疫苗生产后检测外源病毒。除了使用不同公司的商业疫苗外，还评估了几个候选菌株的保护效果（表3）。陈等人选择了主要流行菌株的gB基因，并将其插入FPV（FPV疫苗株282E4）基因组中，构建了重组病毒rFPV-gB。rFPV-gB在SPF鸡中的保护指数为100%，超过了crFPV（商业传染性喉气管炎病毒（ILTV）重组FPV工程化疫苗）在SPF鸡中的保护指数（83.3%）。挑战菌株和商业疫苗株之间的遗传距离可能导致这种保护差异。然而，无论是商业疫苗还是rFPV-gB在减少病毒排毒方面都没有效果，未能防止排毒的疫苗可能会产生选择压力，导致更致病的ILTV菌株的出现，最终导致现有疫苗的保护效果降低。表3中提供了其他重组FPV作为免疫原的信息。
研究表明，使用编码细胞因子的FPV载体，包括白细胞介素（IL）-6或γ干扰素，是一种可靠和有效的疫苗策略，可以用于选择性调节免疫反应。或者，IL-18有增强保护效果的潜力。陈等人将鸡IL-18插入到活重组FPV疫苗（fpIBD1）针对IBDV的非必需开放阅读框（ORF）030中，同时敲除潜在的IL-18结合蛋白（ORF FPV073和ORF FPV214）。结果表明，与原始的fpIBD1相比，后者不能避免IBDV感染引起的法氏囊损伤，fpIBDI∆073::IL-18和fpIBD1∆214::IL-18在IBDV挑战后都提供了完全保护，没有法氏囊损伤或在鸟的法氏囊中检测到IBDV（表3）。总之，细胞因子和其他免疫调节因子的共表达可以提高重组FPV的免疫保护。然而，重要的是要保持警惕，接种了活减毒FPV疫苗的鸡和野生鸟类仍然有发生Avipoxvirus爆发的潜力，这可能与气候条件、养殖密度、广泛的宿主范围或免疫抑制病毒共感染有关。这些发现表明，需要保持永久性的警惕，并改进卫生和疫苗接种计划。
2.3 禽腺病毒
根据最新的ICTV分类，FAdV属于腺病毒科Aviadenovirus属。腺病毒科的病毒颗粒具有二十面体形态且无包膜；基因组是一个26-45 kbp的线性双链DNA分子。由于腺病毒能够有效地将大型外源DNA分子引入目标细胞，允许作为足够稳定的冻干制剂进行包装，并且有强大的体外构建和生产高滴度病毒的协议，一些腺病毒已被开发为重组疫苗以预防家禽疾病（表2）。基于血清交叉中和试验或它们的分子结构，FAdV进一步分为12个血清型（FAdV-1–8a, 8b–11）或五个种（FAdV-A–E）。在家禽养殖中，FadV-4与肝炎-心包积液综合征（HHS）相关，这导致小鸡的高死亡率并造成重大的经济损失，根据流行病学调查显示广泛流行。特别是在过去十年中，许多国家出现了趋于地方性爆发的增加趋势，而不是偶发事件。因此，FAdV-4被广泛用作重组疫苗开发的平台。此外，FAdV-8、FAdV-9、FAdV-10和HAdV-5也已被开发为预防家禽疾病的重组疫苗。
发展重组DNA技术为重组FAdV的产生提供了更有效的策略，例如cosmid、fosmid、CRISPR-Cas9和Cre-LoxP系统，这些是构建重组病毒的常用策略。例如，在基于cosmid的策略中，腺病毒基因组和一个携带左右同源臂的cosmid载体共转化到大肠杆菌中，通过同源重组产生感染性克隆。随后，通过用限制性内切酶线性化感染性克隆并转染细胞来产生重组病毒。可以根据感染性克隆使用筛选标记进行外源基因的替换（图1）。同样，也可以利用基于fosmid的系统构建重组病毒。
近期研究表明，FAdV-4的纤维-2蛋白的N和C末端和纤维-1蛋白的N末端可能是开发减毒活疫苗候选物或表达外源抗原的疫苗载体的潜在插入位点。例如，郭等人成功地工程化了一个重组病毒FAdV4-HA(H9)，通过替换纤维-2的轴和结区域表达H9N2流感病毒的HA基因。随后的动物研究表明，这种重组病毒表现出减毒，并在早期阶段对H9N2流感病毒诱导了血凝抑制反应，有效抑制了口咽部的病毒复制。然而，这种重组病毒可能导致25%的死亡率（表3）。此外，纤维-2最近被确认对病毒复制或有效保护FAdV-4都不是必需的，这意味着纤维-2可以用作目标位点，被不同的外源基因替换，以产生基于FAdV-4的疫苗载体，针对其他病原体。因此，通过用FAdV-8a的纤维基因替换FAdV-4的纤维-2基因，产生了一种新的重组病毒FAdV4-F/8a-rF2，它可以诱导高水平的中和抗体，并为FAdV-4和FAdV-8a提供100%的死亡率保护。此外，重组病毒对SPF鸡无致病性（表3）。同样，郭等人通过同样的策略获得了一种新的重组FAdV-4，表达鸭腺病毒3（DAdV-3）的纤维-2蛋白。作者评估了这种重组的一些特性，并发现接种高剂量的重组病毒在感染的两周龄SPF鸡中没有引起任何临床症状。此外，可以诱导针对FAdV-4和DAdV-3的高水平抗体和中和效价。然而，对FAdV-4和DAdV-3的保护效果尚未评估。重组病毒载体疫苗总是期望有高水平的外源蛋白表达以产生有效的免疫反应。然而，研究表明，体外外源蛋白表达水平与抗体产生水平之间可能没有关联。James等人利用携带CMV、CAG或EF1α启动子的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因表达盒，工程化了不同的重组FAdV-9。感染肝癌细胞后，携带CAG或EF1α启动子的重组体比携带CMV启动子的重组体有更高的蛋白表达水平，后者在鸡中对EGFP的血清转化率最高，这可能是因为CAG启动子下的高水平外源蛋白表达可能超过了抗体产生的最高阈值剂量。这些发现表明，候选重组病毒载体疫苗的选择应基于体液免疫反应的水平，而不是体外外源蛋白表达水平。
与包涵体肝炎（IBH）相关的FAdV-8也被开发为病毒载体。Johnson等人通过在CFA40菌株的SnaBI和XbaI限制性内切酶位点或SpeI位点之间插入传染性支气管炎病毒（IBV）的S1基因，生成了两个FAdV-8重组体。动物实验表明，6天口服接种可以诱导90-100%的保护，无论是同源还是异源在气管的挑战（表3）。
FAdV的其他血清型也已被用作疫苗载体来表达外源蛋白。为了防止传染性法氏囊病（IBD），在CELO（FAdV-1）基因组的左端插入含有CMV启动子的VP2基因表达盒，以产生CELOa-VP2载体，该载体可以通过一次或两次皮下或皮内注射但不能通过口鼻途径提供对高度致病性IBDV相关的死亡和发病的完全保护（表3）。同样，FAdV-10被用作病毒载体来表达VP2蛋白，重组体可以通过静脉、腹腔、皮下或肌肉注射保护鸡免受中等致病性IBDV菌株的挑战，但不能通过结膜囊提供保护（表3）。表3中提供了其他重组FAdV作为免疫原的信息。尽管已报道了许多FAdV疫苗候选物，但商业上可获得的重组FAdV疫苗仍然不可用。
除了FAdV，一系列研究表明，由于以下显著优势，复制缺陷的人腺病毒血清型-5（HAdV-5）更适合作为疫苗载体来传递外源蛋白：（1）因为HAdV-5在鸡中没有显示出免疫性，它可以有效地避免母体抗体的干扰；（2）HAdV-5载体不会导致病毒的传播，因为它不能在动物中复制；（3）由于HAdV-5基因组不整合到宿主基因组中，HAdV-5载体不能干扰其他宿主基因的表达；（4）最后，HAdV-5载体可以通过不同的途径给药。徐等人使用AdEasy系统构建了三种HAdV-5重组体，该系统已作为一个试剂盒商业化：（1）rAd5-F：仅表达NDV（基因型VII NDV菌株DHN3）F蛋白；（2）rAd5-VP2：仅表达IBDV VP2蛋白；以及（3）rAd5-VP2-F2A-F：共表达F和VP2蛋白。所有rAd5构建物都通过肌肉注射用于免疫。动物实验表明，rAd5-F和rAd5-VP2-F2A-F分别在SPF鸡中对NDV菌株DHN3的挑战后提供了100%和86%的生存率。然而，两种重组体都没有防止病毒排毒。rAd5-VP2和rAd5-VP2-F2A-F在IBDV菌株BC85/86的挑战后都提供了86%的生存率。所有重组体都能在SPF鸡中诱导与减毒菌株rDHN3-mF和商业HVT-VP2载体疫苗相似的有效的细胞免疫反应，但抗体诱导较弱，这可能是由于抗体检测方法。然而，更合理的解释是HAdV-5的复制缺陷导致在鸡中外源蛋白表达水平低，刺激了较弱的体液免疫反应，这可以通过增加重组腺病毒的剂量和免疫次数来改善。鉴于HAdV-5作为重组载体开发平台的潜力，已有多篇报告专门研究了表达病毒抗原的重组HAdV-5，包括NDV、Mycoplasma gallisepticum、IBDV和Chlamydophila psittaci。HAdV-5重组体的一个缺点是它们可能与人类293衍生细胞基因组的E1区域重组，产生具有复制能力的重组病毒。然而，在PER.C6或CER8细胞中没有发现类似的重组，这些细胞适合生产HAdV-5重组体。
2.4.鸡新城疫病毒
由新城疫病毒（NDV）引起的鸡新城疫（ND）是一种高度传染性的病毒性疾病，与家禽业的重大经济损失有关。根据最新的ICTV分类，NDV，也称为Orthoavulavirus javaense，是Avulavirinae亚科Orthoavulavirus属的成员。尽管许多国家加大了疫苗接种策略的实施，但ND的爆发仍然频繁发生。因此，预防NDV应该继续是家禽业的主要焦点。近几十年来，LaSota和其他NDV疫苗株，包括I-2、B1、Clone 30和VG-GA，已经得到广泛应用，并在对抗ND方面取得了显著进展。此外，一些已被用作疫苗载体，有效地表达异源蛋白，因为它们具有以下显著优势：(1) NDV具有相对短小且简单的基因组，大约15 kb，编码六种结构蛋白；(2) NDV的反向遗传系统已被广泛用于产生减毒的NDV载体候选物；(3) NDV在灵长类动物的呼吸道中表现出高效的复制能力，诱导粘膜和系统免疫反应；(4) 由于NDV在细胞质中复制，NDV基因组不整合到宿主基因组中。此外，涉及NDV基因组的重组事件极为罕见；(5) NDV基因组可以表达多个外源基因，并且可以通过操纵插入位点来调节表达水平（表2）。发现当插入位点靠近3′端时（NP和P基因之间除外），外源基因的表达水平更高，但生长动力学略有延迟。NDV的第一个反向遗传系统由Peeters等人在1999年建立。简而言之，三个分别表达NP、P和L蛋白的质粒，以及一个包含NDV完整基因组的质粒，该基因组受T7启动子的控制，共同转染到感染了表达T7 RNA聚合酶的重组FPV（FPV-T7）的细胞中，导致NDV抗原体RNA的合成。NP、P和L蛋白负责复制和转录抗原体RNA。最后，SPF鸡胚扩增重组病毒。近几十年来，NDV反向遗传系统已经开发并持续改进，主要关注T7 RNA聚合酶的获取和含有NDV完整基因组的质粒启动子的优化。例如，一种高度减毒的宿主范围限制的改良牛痘病毒Ankara，它不能在人类和大多数其他哺乳动物细胞中复制，但支持在CEF细胞等禽类细胞中的复制，被用于表达T7聚合酶，这导致细胞病变效应降低，并为T7聚合酶表达提供了足够的时间。更重要的是，减少了与牛痘病毒相关的生物安全问题。此外，BSR T7/5细胞已被用于简化NDV反向遗传系统，该细胞可以在培养中稳定表达噬菌体T7 RNA聚合酶。除了T7启动子，可以被RNA聚合酶II识别的启动子，如CMV，也已被用于转录NDV的抗原体RNA。同时，锤头状核糖体酶序列和乙型肝炎病毒δ核糖体酶序列分别插入抗原体序列的5′和3′端，以获得具有精确末端的抗原体RNA。研究表明，基于BHK-21细胞的CMV启动子系统有助于产生rNDV，并与基于BSR-T7细胞的T7救援系统相比表现出更高的效率。由于这些优化策略，NDV的反向遗传系统已变得非常简便高效。然而，它仍然存在一定的挑战。最值得注意的是，基因组的复杂性和长度使得全长高保真cDNA的产生成为救援NDV过程中最艰难和耗时的步骤。为了克服这一挑战，无连接克隆被用来构建NDV全长cDNA克隆。Yu等人根据不同基因型的NDV菌株的保守基因组区域设计了两对NDV“基因型通用”引物，使用两步无连接克隆策略生成了三个全长cDNA克隆，包括LaSota、VG/GA和F48E9。与传统克隆方法相比，这种策略显著减少了克隆步骤的数量，并缩短了NDV救援所需的时间至几周。四种不同的质粒成功转染到一个细胞中的概率低，以及至少产生一个可行且可复制的病毒颗粒是传统反向遗传救援NDV的挑战的另一个因素。Liu等人报告了一种改进的救援策略，只需要两个质粒，pNPL和NDV全长克隆，在CMV启动子的控制下。该系统通过将两个质粒共同转染到BHK-21细胞中，然后收集细胞和上清液进行病毒扩增，实现了NDV的救援。这种策略的两个显著优点是节省时间和能够救援无法摄取四种质粒的病毒，特别是对于减毒菌株（图1）。最近，开发了一种从单一质粒中救援病毒的新系统。该系统巧妙地在P和L基因前插入了T7启动子序列。将质粒转染到感染了表达T7 RNA聚合酶的禽痘病毒的细胞后，产生了三种不同的RNA物种，包括全长病毒RNA和两个亚基因组RNA。随后，这些mRNA转录本被用来合成NP、P和L蛋白，产生传染性病毒颗粒。由于只需要一个质粒，该系统极大地提高了病毒的救援效率，对NDV的反向遗传具有重要的应用价值。过去20年来，已对rNDV作为家禽实验疫苗进行了评估。已产生并评估了表达流感HA糖蛋白、FAdV-4纤维-2蛋白、IBDV VP2蛋白、IBV S蛋白、MDV gB蛋白、ILTV gD蛋白和σC蛋白的各种rNDV，以评估其在家禽中的免疫保护效果。表3中提供了用作免疫原的rNDV的信息。一些研究表明，LaSota仍然是开发重组病毒载体的首选，因为它能够诱导强烈的免疫保护并具有安全特性。此外，还进行了优化LaSota基因组的研究。例如，用热稳定菌株的HN基因替换，可以获得热稳定性，从而降低疫苗接种成本，特别是对发展中国家和欠发达国家有利。这是NDV作为疫苗载体的独特优势。此外，通过用当地流行菌株的F或HN基因替换，可以更好地实现保护。P和M基因之间的间隔区域被认为是外源基因的热门插入位点，因为它们不仅确保了外源蛋白的有效表达，而且与亲本病毒相比，对重组病毒的复制效率影响很小。尽管提供了有效的保护，但除了含有H5 AI血凝素基因插入的重组ND疫苗（中国哈尔滨维科生物科技发展公司，哈尔滨，中国）外，很少有商业上可获得的疫苗。最重要的原因之一是母体来源抗体的干扰，这限制了NDV载体疫苗在家禽中的使用。为了克服MDA干扰，已经采取了许多努力，包括更高剂量的抗原、更具侵略性的疫苗菌株，以及通过细胞因子刺激恢复B细胞反应。未来，预计重组NDV的贡献将取得更多进展并得到证实。
2.5.其他重组病毒载体
除了上述常用的病毒载体外，IBV、ILTV和鸭病毒性肠炎病毒（DEV）也越来越多地被用作病毒载体，以控制家禽常见的病毒性疾病。根据ICTV的最新版本，IBV属于Igacovirus亚属、Gammacoronavirus属、Orthocoronavirinae亚科和Coronaviridae科，具有大约27-28 kb长的线性、正单链RNA基因组。IBV基因组的大尺寸、其外源基因表达能力以及对IBV疫苗的持续需求使它们适合用于开发病毒载体疫苗。Bentley等人成功地替换了三个不同的IBV基因组区域，Gene 5、ORFs 3a和3b或IR，与报告基因eGFP或hRluc，所有重组病毒都能成功表达报告基因。值得注意的是，替换了Gene 5的重组病毒表现出最大的稳定性，表明IBV有潜力作为其他禽类病原体的疫苗载体。随后，Yang等人将IBV-H120的5a基因替换为NDV-LaSota的HN基因，产生了一种重组IBV病毒，提供了80%的保护，可以抵抗强毒IBV和NDV的挑战。达到的保护水平与商业疫苗相当。此外，近期研究表明，替换S1基因与不同菌株的相应基因可以提高IBV重组的交叉保护效率。例如，将Beau菌株的部分S1基因替换为QX样菌株的基因，可以提供对两种不同基因型的IBV的广谱保护，这也证明了其作为病毒载体的潜力。
先前的研究表明，具有大基因组的传染性喉气管炎病毒（ILTV）也有作为病毒载体的潜力，已被用来表达流感病毒的H5或H7蛋白并获得有效的免疫保护。此外，ILTV活疫苗可以通过便捷的途径，例如眼药水、喷雾和饮水，轻易地给大批动物接种。然而，目前重组ILTV疫苗并不普遍，可能因为ILT活疫苗在非常年幼的小鸡中的效力较低。
除了在家禽中常用的病毒载体疫苗外，鸭病毒性肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒科，由于其大基因组（约158 kb），被用作预防鸭常见病毒或细菌病的病毒载体。更重要的是，DEV减毒活疫苗可以在几小时内迅速诱导保护性免疫，其效力不受母体抗体的影响。这些优势使它逐渐成为载体疫苗研究的热点，近年来经常被报道，包括用作病毒载体表达多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H（OmpH）、NDV的F蛋白、H5和H7流感病毒的血凝素基因以及鸭肝炎病毒3的P1和3C蛋白。所有这些重组体对特定病原体都具有有效的免疫保护。DEV载体有望成为预防鸭常见病毒和细菌病的有力武器。
3.结论
自21世纪初以来，已创建并评估了多种基于重组活病毒载体的疫苗菌株，以评估其对各种家禽疾病的免疫学效应。与传统疫苗相比，它具有长期免疫保护的显著优势（表4）。尽管重组病毒载体疫苗逐渐出现并普遍有效，但一些重组载体疫苗的性能受到新生雏鸡高水平母源抗体存在的干扰。这一因素严重影响了重组载体疫苗的商业化。相比之下，HVT在逃避母源抗体干扰和确保安全性方面具有明显优势，使其在其他病毒载体中脱颖而出。在现有的免疫计划中广泛采用重组HVT疫苗值得考虑实施。例如，给18天龄的胚蛋或1天龄的小鸡接种基于HVT的疫苗是保护幼龄小鸡免受ND、MD和AI风险的有希望的策略。此外，对于威胁年龄较大的鸡的病毒感染，如ILT或FAd，使用基于FPV的疫苗可能是更好的选择。因此，多价插入病毒载体疫苗应该是下一阶段研究的重点。重组活载体疫苗的广泛应用将大大简化免疫过程，节省人力物力资源，并通过减少疫苗接种次数改善动物福利。
为了进一步提高免疫保护效果，结合传统疫苗和载体疫苗可能解决这一问题。例如，与单独接种表达NDV F抗原和ILTV gD和gI抗原的rHVT（提供88%保护）相比，将重组载体与CVI988结合使用，提高了对vv MDV RB1B菌株的保护效果（提供98%保护）。此外，根据Palya等人的实验结果，在1日龄时接种rHVT-ND，然后在6周龄时接种商业活疫苗，在15周龄时接种灭活疫苗，显著提高了对NDV的抗体水平，并进一步减少了病毒排毒。
由于大多数病毒载体的基因组广泛，构建相应的反向遗传系统是一个重大挑战，阻碍了重组疫苗的研究和开发。在这种情况下，利用小基因组，一种不包含对复制或毒力非必需的基因（保留抗原性）的工程化病毒基因组，呈现出有希望的应用。通过大幅度减少病毒基因组的长度，这种方法便于快速开发反向遗传系统，高效产生多种重组载体疫苗。这种策略可能适用于HVT、MDV、ILTV和FPV等病毒。
在过去二十年中，在家禽行业利用重组病毒载体疫苗方面取得了显著进展。未来的努力应该优先考虑将更多的重组活载体疫苗纳入免疫计划，并将各种疫苗类型和生物佐剂与重组病毒载体疫苗战略性整合，以合理的成本赋予强大的免疫力并防止病毒排毒。未来十年将是致力于重组病毒载体疫苗研究社区的有趣发展时期。
