文献分享
大家好，今天向大家分享一篇发表在International Journal of Biological Macromolecules杂志上题为“Identification of two novel B-cell epitopes located on the spike protein of swine acute diarrhea syndrome coronavirus”的文献。
研究背景
猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)属于冠状病毒科甲型冠状病毒属，基因组约27 kb，由单链正义RNA组成。SADS-CoV的主要结构蛋白包括核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、小包膜蛋白(E)和刺突蛋白(S)。S蛋白是位于冠状病毒表面的三聚体1型糖蛋白。冠状病毒进入宿主细胞取决于病毒表面的三聚体S蛋白与宿主细胞受体之间的特异性相互作用。S蛋白为同型三聚体，每个单体分为S1和S2两个区域。S1蛋白呈球状结构，由两个不同的功能亚域组成：S1亚基N端域(S1-NTD)和S1亚基C端域(S1-CTD)。S1-NTD主要与糖受体结合，而S1-CTD则与蛋白质受体结合。因此，S1亚基通常是一个关键的中和区，也是疫苗开发的关键靶点。猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是一种新出现的甲型冠状病毒，可引起仔猪腹泻并造成严重的经济损失。在SADS-CoV感染期间，刺突蛋白(S)作为病毒粒子的关键结构成分，与受体相互作用并引发产生中和抗体。由于SADS-CoV具有人畜共患传播的潜在风险，S糖蛋白表位的鉴定和筛选对于开发敏感和特异性的诊断工具至关重要。
研究结果
1. 重组SADS-CoV S蛋白的表达与纯化
SADS-CoV S蛋白由两个亚基组成，负责不同的功能：S1亚基由四个核心结构域(NTD、CTD、SD1和SD2)组成，促进细胞附着，而S2亚基负责病毒和宿主细胞膜之间的融合(图1A)。作者设计了一种来自人组织纤溶酶原激活因子(tPA)的信号肽，以取代病毒原始的S蛋白信号肽(1-17aa)。此外，作者在C端加入了三聚化序列和His纯化标签，以促进S三聚化蛋白和S1蛋白的表达(图1B)。重组二聚体S三聚体和S1蛋白在哺乳动物HEK293F细胞中的表达通过SDS-PAGE和western blot进行评估(图1C, D)。对煮沸的变性和未变性重组蛋白样品进行western blot检测显示，后者具有更大的分子量(图1E)。亲和层析纯化后，重组S三聚体蛋白呈现出清晰的单蛋白带，足以用于后续的免疫。第三次免疫后(图1F)，采集血清样本进行ELISA检测S1特异性IgG抗体。在刺激后28天，S三聚体免疫组产生高水平的s1特异性IgG抗体(图1G)。
2. SADS-CoV S蛋白特异性单抗的制备和鉴定
用纯化的S三聚体蛋白免疫BALB/c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术制备8D6和6E9两种单抗。通过免疫荧光检测，这些抗体与SADS-CoV感染的LLC-PK细胞反应良好，但与PEDV、TGEV或PDCoV感染的细胞没有反应(图2A)。为了确定这些单抗是否识别构象表位或线性表位，作者进行了Western Blotting。单抗8D6和6E9都能与真核表达的S 三聚体蛋白反应，但不能与空质粒转染的样品反应(图2B)。此外，这两种单抗与感染SADS-CoV的细胞样品发生反应(图2C)，表明单抗识别的8D6和6E9表位是线性的。采用ELISA法检测单抗对SADS-CoV S1蛋白的亲和力。单抗8D6的EC50为308.2 ng/mL, 6E9的EC50为1006 ng/mL(图2D)。采用免疫组化方法验证单抗8D6和6E9能否在接种 SADS-CoV的动物小肠中识别S蛋白。单抗8D6和6E9在这些动物的回肠中特异性检测到SADS-CoV S蛋白，而在对照动物中没有检测到(图 2E)。
3.单抗表位定位
为了鉴定抗s单克隆抗体8D6和6E9识别的表位，作者设计了一组与hFc或GST标签融合的截短多肽，并在HEK293T细胞中表达(图3A)。最初，S蛋白被分成6个片段：肽S1A (aa 1-546)、S1B (aa 251-546)、 S1C (aa 251-403)、S1D (aa 276-546)、S1E (aa 276-404)和S1F (aa 1 275)。单抗8D6识别S1A、S1B、S1C、S1D和S1E，但不识别S1F，这表明8D6单抗的表位位于a276 ~ 404。单抗6E9能与肽段S1A、S1B和 S1D反应，但不能与S1C、S1E和S1F反应，提示单抗6E9的表位位于 aa 404-547内(图3B)。为了确定抗s单抗8D6和6E9识别的表位，构建了 一个与GST标签融合的截短多肽面板(图3C和4A)，并在HEK 293 T细胞中表达并进行Western Blotting。以8D6为例，第二轮进一步定位将表位缩小到aa 295-319(图3D)。在第三轮中，确定了aa 309-319(图3E)。最后，一个最小的肽311NPDQRD316被表征为单抗8D6识别的b细胞表位 (图3F)。同样，6E9识别的最小表位被定义为492ARFVDRL498(图4A-D)。
5. 序列与同源性分析及表位空间位置分析
结论
基于其他冠状病毒，已知S1结构域含有多个病毒中和性表位和受体结合结构域。这些特征表明S1是筛选和鉴定抗原表位的合适候选者。总之，作者制备了两种针对SADS-CoV S1结构域的单克隆抗体8D6和6E9，并鉴定出两个独特的保守的B细胞表位311NPDQRD316和492ARFVDRL498。作者的发现为进一步研究S蛋白的功能提供了单克隆抗体，并为血清学诊断和疫苗开发奠定了基础。
