摘要：轮状病毒是严重急性儿童胃肠炎的主要原因，每年导致超过128,500人死亡，主要在低收入国家。尽管自2006年左右首批疫苗推出以来，死亡率已显著下降，但仍有估计83,158人死亡是可以预防的。目前部署的两种主要疫苗，Rotarix和RotaTeq，都是活体口服疫苗，已被证明在发展中国家的效果较差。此外，它们与肠套叠的轻微风险有关，并且需要冷链维护，这限制了这些疫苗在某些地区的可及性，导致全球65%的儿童未接种疫苗，因此未受保护。在这种背景下，我们在这里回顾了主要在开发中的疫苗和潜在替代品的最新技术。
1. 背景
轮状病毒（RV）感染是导致儿童严重急性胃肠炎的主要原因，占6岁以下儿童腹泻发作的大多数，并不仅在人类中，而且在多种动物物种中，是腹泻死亡的主要原因。3至24个月大的儿童病例显示发病率和严重程度更高。尽管儿童腹泻或病毒性胃肠炎一直是世界历史上公认的问题，但首次与人类RV相关的感染可以追溯到1973年。2016年，RV在全球范围内造成了约128,500人死亡，主要在低收入国家（LICs）；然而，自从2008年左右RV疫苗引入疫苗接种计划以来，这种病毒造成的死亡人数已显著减少，当时每年的死亡人数达到453,000人。其他研究估计，在疫苗引入之前，RV每年导致约1.11亿次胃肠炎发作；2500万次医生就诊；200万次住院治疗；平均每年在35.2万至44万人死亡之间。RV在肠道细胞内复制，导致急性胃肠炎（AGE）并在粪便中排出病毒。据估计，大约一半与RV相关的死亡发生在仅仅四个国家：印度、尼日利亚、巴基斯坦和刚果民主共和国。自2006年以来，世界卫生组织（WHO）已推荐在欧洲和美洲的疫苗接种计划中包含RV疫苗，并于2009年将这一建议扩展到全球。到2018年，共有92个国家在其国家免疫计划中引入了RV疫苗，另外六个国家以分阶段或区域性的方式引入了这些疫苗。与此同时，在资源较少的国家，疫苗引入得到了GAVI（疫苗联盟）的支持。在73个潜在的援助接受国中，46个国家在2019年引入了疫苗，另外八个国家最近被选为援助对象，并计划在未来引入疫苗。尽管RV的发病率在LICs中更高，但这种病毒并不局限于这些国家；事实上，它的影响在全球范围内都能感受到。例如，在欧洲联盟引入疫苗之前，RV每年导致约360万次AGE发作，70万次医生就诊；8.7万次住院治疗；以及5岁以下儿童每年231人死亡，尽管自疫苗引入以来住院治疗减少了90%。此外，据估计，大多数儿童即使未被诊断，到5岁时至少已感染过一次，表明这种病毒造成的健康负担被低估了。同样，尽管RV造成的死亡主要集中在儿童身上，但RV感染也可以影响成年人的一生，尽管感染可能是轻微的或甚至是无症状的。RV是Reoviridae家族的一个属，只包括感染脊椎动物（鸟类和哺乳动物）的病毒。RV有一个由11个双链RNA分子组成的分段基因组，其30和50端被保留。基因组编码六种结构蛋白（VP1-VP4，VP6和VP7）和六种非结构蛋白（NSP1-NSP6）。所有片段都是单顺反子的，除了第11段，它编码两种非结构蛋白（NSP5和NSP6）。病毒颗粒显然是球形的，直径在70到100纳米之间，具有二十面体衣壳，没有脂质包膜。传染性颗粒由三层同心的蛋白质形成，这种结构被称为三层颗粒（TLP）。内层衣壳包含围绕基因组的VP2蛋白和几分子VP1蛋白（病毒RNA依赖性RNA聚合酶）和VP3（具有鸟苷酰转移酶和甲基化酶活性的蛋白）；中间衣壳由VP6组成，负责主要的RV分类。外层衣壳也由VP7蛋白和从病毒粒子表面伸出的VP4刺组成。两种外部衣壳蛋白，VP7和VP4，具有中和表位，在病毒进入和感染目标细胞中起着重要作用。在肠道中，表面刺，VP4，由于蛋白酶的存在，被蛋白水解成两个亚单位，VP8和VP5。VP8负责特异性结合到目标细胞，VP5负责膜穿透和进入细胞。在感染期间，外层的一系列分子转化将这层从其余部分分离出来，以便只有转录活跃的内层衣壳，称为DLP，进入细胞质。传统的分类系统基于三个结构蛋白的基因组组成和免疫学反应：VP6、VP7和VP4。根据VP6蛋白，它们可以被分类为九个物种：A到I组，最近提出了J组。A、B、C和H RV与人类和动物的AGE有关。四种中最常见的，RVAs，负责人类和动物中超过90%的感染。根据与两种亚组特异性单克隆抗体对VP6的反应模式，可以区分出四个RVA亚组（SGI、SGII、SGI1II和SG nonI-nonII）。在这四个亚组中，SGII在人类中最常见，而SGI在感染动物中最为常见。两种外部衣壳蛋白VP7和VP4触发中和抗体的产生，这些抗体可以赋予针对病毒感染的保护性免疫。血清型/基因型由这两种外部衣壳抗原定义：VP7决定血清型G（一种糖蛋白）和VP4血清型P（通过对蛋白酶的敏感性），P[4]、P[6]和P[8]是最常见。总体而言，有五种流行的基因型：G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8]，它们占全球流通菌株的90%以上。目前，全球已描述了36种G和51种P类型，其中G1P[8]基因型在疫苗时代之前最为常见。然而，在疫苗引入后，不同国家的流通基因型多样性显著增加，包括韩国、英国和巴西，基因型G2P[4]的主导地位更高。此外，一些研究报告G12P[8]是在疫苗时代之后流行率增加最多的基因型之一。即便如此，据估计P[8]基因型负责超过80%的人类感染。在这个基因型内，已经描述了四个不同的谱系：P[8]-谱系I、P[8]-谱系II、P[8]-谱系III和P[8]-谱系IV。此外，分子特征技术的最新进展揭示了P[8]基因型可以抗原性地划分为不同的亚型：P[8]a（由谱系I和III组成）和P[8]b（也称为OP354-like，由谱系IV组成）。世界上流通的大多数菌株属于亚型P[8]a，而亚型P[8]b较少见。通常，使用血清型或基因型术语取决于是否使用了免疫学检测（MAb-ELISA和交叉中和试验）或基于核酸的方法（测序、RT-PCR或寡核苷酸探针杂交）。除了这个系统，还有一个基于NSP4蛋白基因型的系统，NSP4是一种病毒肠毒素。2008年4月，轮状病毒分类工作组（RCWG）根据RVA组的11个基因组段的核苷酸序列，开发了一个完整的基因组分类系统。这种新的分类系统为特定RV株的每个基因组段分配了一个特定的基因型，根据既定的核苷酸百分比截止值。在这种方法中，组成RV株基因组的不同基因（VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5/6）使用以下缩写：Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx，其中x代表从一开始的阿拉伯数字，根据上述百分比分配。
换句话说，这个系统为编码特定蛋白质的基因的核苷酸序列分配一个数字。随后，在分析某一特定菌株的基因序列时，如果这个基因与之前描述的序列（已经分配了某个数字）有85%的相似性，它就会被赋予相同的值。另一方面，如果这个序列与已定义的序列有超过15%的差异，它就会被赋予一个新的数字，按照列表的顺序。最后，与VP7和VP4蛋白相关的数字得以保留。这个新系统使得主要的RV星座得以分类。尽管A组内许多不同的RV类型具有不同的P和G基因型，能够感染人类，但目前可用的大量完整基因组数据表明，只有两种不同的基因型星座的RVA菌株能够在全球范围内长期感染人类。这两个星座被称为Wa-like和DS-1-like，分别被分配了以下分类：I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1和I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2，不包括G和P基因。还有一个第三基因型星座的RV，其传播能力更有限，被称为AU-1，被分配了以下分类：I3-R3-C3-M3-A3/A12-N3-T3-E3-H3/H6。这些星座，尽管不是由G和P基因型定义，但往往具有以下基因型：Wa-like情况下的G1P[8]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]、G12P[6]和G12P[8]，以及DS-1-like情况下的G2P[4]。总之，这个新的分类系统不仅可以用于将不同的菌株分组到星座中，而且还可以轻松识别不同菌株或星座之间的重组。
2. HBGAs作为病毒受体及其意义
对病毒感染的先天抵抗力可以归因于参与免疫反应或受体/配体相互作用的基因突变。在轮状病毒（RV）中，对感染的抵抗力似乎是基因型依赖的，主要由血型抗原（HBGAs）介导，并且可能受到微生物群组成的影响。超过30年来，唾液酸被认为是动物轮状病毒的糖苷受体，然而，人类菌株被认为与唾液酸无关。最近发现HBGAs作为潜在受体的角色，显著推进了对RV多样性、进化和流行病学的理解。HBGAs表达在目标细胞表面，并作为病毒受体。它们的合成由岩藻糖基转移酶和糖基转移酶介导，受FUT 2（分泌型）、FUT 3（Lewis型）和ABO（H）基因的控制。此外，两种主要疫苗（Rotarix和RotaTeq）与对自然感染的类似敏感性有关，并且由于HBGA在不同人群和种族之间的分布不同，这是在考虑不同人群中疫苗的有效性和保护性时需要考虑的一个重要因素。
HBGA的合成通过在前体分子（二糖）上顺序添加单糖来实现，这一过程在图1中展示。前体由一个与N-乙酰氨基葡萄糖分子（GlcNAc）结合的半乳糖分子（Gal）组成一个二糖。根据连接两种糖的键，前体被分类为两种不同的组：I型（β-1,3连接）或II型（β-1,4连接）。分泌型状态由FUT 2基因决定，该基因编码α-2-岩藻糖苷酶2（在Gal残基的α-1,2位置添加一个岩藻糖残基），非分泌型个体缺乏该酶的功能性，因此无法表达H抗原。这个系统内的另一个基因编码FUT3（Lewis基因），它在初始前体的GlcNAc基序或I型或II型的H（分泌型）的α-1,3或α-1,4位置添加另一个岩藻糖残基。总之，根据隐性或显性等位基因的存在，个体可以是分泌型或非分泌型，以及Lewis阳性或Lewis阴性。多项研究表明HBGAs与轮状病毒远端VP8刺突VP4部分（约27 kDa，N-末端）之间存在相互作用，人们认为表达在目标细胞表面的HBGAs作为病毒受体。有证据表明P[8]和P[4]基因型与Lewis b和H1型抗原结合，P[6]基因型与H1抗原结合，P[19]基因型与粘液核心糖和I型HBGA前体结合。此外，P[9]、P[14]和P[25]基因型特别结合到A型抗原，而P[11]结合到II型前体糖。最近的研究通过晶体学证明H1及其前体，乳N-二糖（LNB），与VP8 P[8]蛋白结合，与LNB相比，H1抗原的亲和力增加了两倍，为非分泌型人群中轮状病毒P[8]基因型感染性较低提供了解释。此外，LNB是人类乳汁的基本成分，因此可以作为针对RV的可能抗病毒剂。
综上所述，非分泌型个体被认为对VP8* P[6] RV的感染较不敏感。此外，Nordgren等人报告称VP8* P[6]更倾向于感染Lewis阴性儿童，而Lewis阳性和分泌型阳性儿童更有可能感染VP8* P[8]。这一点在考虑不同人群中基因型分布时尤为重要。例如，在欧洲和北美，估计有20%的人口是非分泌型，限制了VP8* P[6]基因型的传播。然而，在非洲，非分泌型的比例要低得多，因此在扩张上遇到的障碍较少，这解释了P[6]基因型在该大陆（以及在亚洲较小程度上）的丰富性。在马里、加纳、肯尼亚、孟加拉国和越南等国家进行的研究报告了VP8* P[6]基因型的高流行率，在某些情况下高达84.8%，这突出了在LICs中针对这一基因型提供保护的重要性。这些受体的发现，以及不同（主要是LIC）人群的基因型分布，可能为个性化疫苗铺平道路，这些疫苗可以针对特定人群主要感染的特定基因型提供保护。
图1. HBGAs的生物合成途径。它们是通过在前体糖链的末端二糖顺序添加单糖来合成的。该图显示了从1型和2型前体开始的合成途径。糖苷键通过对角线分隔开来，以指定不同链的途径。岩藻糖基转移酶FUT2和FUT3分别通过催化特定α-岩藻糖残基的添加，推动分泌型（Se）和Lewis（Le）抗原的生物合成。酶A和B分别催化N-乙酰半乳糖胺和半乳糖的特定添加。酶A、B和FUT2向前体半乳糖残基添加糖链，结果产生ABH HBGA。酶FUT3向N-乙酰氨基葡萄糖残基添加α-岩藻糖产生Lewis抗原（Lewis a/x, Lewis b/y, A Lewis b/y, B Lewis b/y）。
3. RV疫苗管线
1983年，Bishop等人报告称，在生命的第一个月感染RV的儿童对由再感染引起的中度至重度疾病具有保护作用。这是第一个证据表明RV疫苗是可能的，但也为潜在疫苗设定了一定的限制，因为它不能预防由再感染引起的轻度疾病。第一个上市的疫苗是Rotashield（Wyeth-Lederle）。然而，由于1999年7月发生肠套叠病例，它在上市9个月后被撤回。肠套叠是肠段相互套入，如果不及时治疗，可能会导致致命的医疗紧急情况。七年和数百万人死亡后，两家公司（默克和GSK）在2006年推出了他们的疫苗（分别是Rotarix和RotaTeq），这导致了腹泻住院率降低了90%。自那以后，全球最广泛使用的疫苗一直是RotaTeq和Rotarix，尽管印度最近开发了两种其他疫苗：Rotavac（Bharat Biotec）和Rotasii（印度血清研究所）（这两种新许可的疫苗仅在印度（两者）和巴勒斯坦（仅Rotavac）使用）。在世界其他地区，2018年，74个国家在其国家免疫计划中包括了Rotarix，14个国家使用了RotaTeq，9个国家使用了两者（国际疫苗接种中心（IVAC），2020年）。总的来说，RV疫苗已在130多个国家获得许可，并被106个国家纳入其国家免疫计划。所有这些疫苗都由WHO预先认证，是活减毒口服疫苗，给予6至8周大的儿童。Rotarix分两次剂量提供，时间间隔一个月，而RotaTeq、Rotavac和Rotasii分三次剂量给予。
3.1. 已获批准的疫苗
在接下来的部分中，我们将概述全球最广泛使用的疫苗以及在不同国家获批使用的疫苗的主要特点。
3.1.1. 全球获批疫苗
Rotarix（RV1—GlaxoSmithKline Biologicals，比利时里克森） Rotarix是一种针对G1P[8]抗原的单价疫苗。研究表明，在发达国家，该疫苗可预防82%由RV引起的重度腹泻病例，约占所有重度儿童腹泻病例的37%。然而，在发展中国家，它仅能预防35%的VR腹泻病例，占所有重度儿童腹泻病例的17%。
RotaTeq（RV5—Merck and Co. Inc.，美国新泽西州肯纳尔沃思） RotaTeq是一种含有五种RV G基因型的五价疫苗，这些基因型通过人类病毒和牛病毒（牛WC3和人类G1、G2、G3、G4和P[8]血清型的表面病毒蛋白）之间的重排而结合。在低死亡率国家，它可预防82%与VR相关的腹泻病例。然而，与Rotarix一样，其在高出生率国家的效力降低至41%，预防重度VR腹泻病例，预防所有重度腹泻病例的15%。
Rotavac（印度巴拉特生物技术公司） 这种针对G9P [11]的单价疫苗缺乏在低婴儿死亡率国家证明其效力的研究，而在印度（一个高婴儿死亡率国家）的效力与前两种情况相似。Rotavac在印度预防54%的腹泻病例，占所有重度腹泻病例的16%。
Rotasiil（印度血清研究所） Rotasiil是一种冻干的五价疫苗，包含人牛重排的菌株，具有G1、G2、G3、G4和G9血清型。它的独特特点是作为首个在其冻干形式下热稳定的疫苗，可在40°C下保持稳定长达18个月。
3.1.2. 国内获批疫苗
这些疫苗在促进负担得起且可获得的RV疫苗接种中发挥着至关重要的作用。
Rotavin-M1（越南河内POLYVAC） 这种针对G1P[8]设计的单价减毒口服疫苗分两次剂量接种，在越南获得批准。它是为使国家自给自足而生产的，分别在2个月和4个月大时接种两剂。
兰州羔羊（中国兰州生物制品研究所） 这是一种口服减毒活疫苗，包含G10P[15]基因型，该基因型于1985年首次分离，一次性接种后每年加强。它在中国获批销售和使用，建议每年给2个月至3岁的儿童接种。然而，由于这种疫苗未被纳入中国免疫计划，其覆盖率相当有限。
简而言之，所有获批的减毒活疫苗已确定两种主要策略。RotaTeq和Rotasiil由宿主范围限制的动物来源的RV减毒而成，由一组重配病毒株生成，其中RotaTeq包含VP7 G1、G2、G3、G4和人类来源的VP4 P[8]，Rotasiil包含VP7 G1、G2、G3、G4和G9。Rotarix和Rotavac由减毒的人类RV菌株培养而成。这些疫苗在发达国家已证明具有高度的保护性免疫；然而，问题在于，它们在LICs中显示出的效力较低，而这些地区正是最需要疫苗的地方，如图2所示。尽管尚未证明LICs口服疫苗效力降低的具体原因，如脊髓灰质炎或霍乱，但通过胎盘途径或母乳获得的高滴度RV抗体的干扰、微量营养素缺乏、营养不良、干扰性肠道微生物群、肠道共感染、并发疾病以及RV流行病学的差异可能导致这种次优表现。口服RV疫苗的另一个主要问题是市场后安全性监测—显示这些疫苗与肠套叠的发病率略有增加，达到每10万名儿童近20例，特别是在接种后的头7天内。尽管其他研究发现，在接种后包括肠套叠在内的严重不良事件风险没有增加。还值得提及的是，在Rotarix中存在猪圆环病毒（PCV）1型DNA，在RotaTeq中存在PCV 1型和2型DNA片段。更糟糕的是，发现Rotarix中的PCV 1型具有传染性，并能在人肝细胞癌细胞中活跃复制。
图2. 口服RV疫苗的有效性与国家人均GDP的关系。展示了四种主要口服RV疫苗（Rotarix、RotaTeq、Rotavac和Rotasii）在不同国内生产总值（GDP）国家的效力。这个图表是根据世界银行的世界发展指标和疫苗效力研究生成的。
轮状病毒在有症状和无症状个体的粪便中以高浓度排出；实际上，据估计，在症状出现之前，个体能够每克粪便排出超过1010–1011个RV颗粒，这些通常可以在未经处理的污水样本中检测到。此外，由于污水处理效率低下或非法污水连接，RV在LICs的不同环境样本来源中非常普遍。这，再加上病毒通过粪-口途径传播，并且不到100个颗粒就足以感染健康个体，为LICs提供了许多感染源。此外，一些研究表明，在接种第一剂或第二剂后，五价疫苗（Rotarix）在婴儿粪便样本中被排除，并且来自疫苗菌株的血清型与儿童胃肠炎病例有关。这些研究表明，减毒活疫苗可能的水平传播以及新重配菌株潜在的环境传播，导致新感染的发展。其他研究同样在接种Rotarix和RotaTeq后相对较短的时间间隔内证明了病毒在粪便样本中的排除，这涉及到疫苗菌株传播的风险。总的来说，从接种疫苗到未免疫儿童的减毒疫苗菌株的传播可以导致群体免疫，为人群的保护做出巨大贡献。然而，它也存在在免疫抑制患者中引起感染的风险。最后，值得注意的是，一些减毒活疫苗在怀孕期间是禁忌的，因为存在胎儿先天性疾病的风险（就像水痘和风疹一样）。
其他障碍，包括疫苗使用的年龄限制、安全问题、减毒活疫苗的特性以及疫苗的高额成本，以及对冷链的需求（有时在LICs中难以维持），目前限制了疾病预防的全部潜力。研究仍在进行中，以克服这些限制，现在正集中在实施新的口服疫苗和开发注射用疫苗上。由于上述原因，据估计2016年发生的128,500例死亡中有约83,158例是可以预防的。其他研究确定，全球只有35%的儿童接种了疫苗，使超过8900万儿童没有得到保护。简而言之，当前RV疫苗的状况反映了近年来的显著进展，但也揭示了仍有许多工作要做。
这种现实与脊髓灰质炎疫苗的情况非常相似。在印度进行的几项研究表明，主要的疫苗OPV（Sabin）在那里的效果不如世界其他地区，原因尚不清楚。在这种情况下，印度的国家脊髓灰质炎根除计划给婴儿接种了多达10剂或更多的OPV，但有些儿童仍然发展为瘫痪。另一种疫苗，注射用疫苗IPV（Salk），于1955年获得批准，与1962年获得批准的OPV相比，几乎未被使用，因为它没有产生相同的群体免疫。然而，随后的研究表明，OPV和IPV的组合可以显著提高疫苗接种的效果[76]。作为5岁以下儿童中估计第五大致命的疫苗可预防疾病[77]，迫切需要改进预防RV感染的方法。
3.2. 正在开发中的疫苗
为了克服这些限制，使疫苗能够惠及全球大多数儿童群体，并提高疫苗诱导的免疫力的有效性和持续时间，研究仍在继续进行新配方（缓冲剂、佐剂等）；新的疫苗接种形式（新生儿剂量、加强剂等）；新的口服疫苗（人类新生儿疫苗RV3-BB）；最后，新的注射用疫苗类型，由于它们直接引入血流，避免了肠道，从而减少了引起肠套叠的风险。然而，由于与传染性RV颗粒的首次接触发生在粘膜层面，因此重要的是不仅要获得系统性免疫，还要获得粘膜免疫。在这方面，不同的研究表明，注射用疫苗能够诱导粘膜免疫。即使在RV中，通过肌肉注射或微针注射的疫苗已被证明能够诱导与口服疫苗类似的粘膜免疫（甚至剂量节省效应）。此外，已有研究报告了注射用疫苗的配方，这些疫苗包含将流量导向粘膜的成分，从而诱导T细胞和B细胞上参考受体的表达及其随后迁移到粘膜部位。总之，现在已经证明注射用疫苗能够产生粘膜免疫。正在开发中的主要疫苗及其当前开发阶段在图3中总结。
图3. 正在开发的RV疫苗。不同的疫苗根据开发阶段进行分层展示。口服疫苗显示在左列，而通过注射途径给药的疫苗显示在右列。粗实线框表示正在寻求新配方的已获批准产品。
3.2.1. 口服疫苗
在正在开发的新疫苗中，最先进的候选疫苗是RV3-BB疫苗（PT BioFarma，印度尼西亚万隆），这是一种基于自然减毒的新生儿RV G3P[6]菌株的口服疫苗。由于这种菌株能够在存在母体抗体的情况下在新生儿的肠道中复制，因此它被针对婴儿进行接种，以提供早期针对RV的保护。
值得注意的一种可能在新RV疫苗开发中特别有用的新技术是植物基础疫苗。作为第一个优势，这种类型的疫苗不需要冷链维护，因为它可以作为种子运输并在行政点现场种植。中国大学生物科学学院的研究人员在玉米种子中开发了一种双价疫苗候选物，表达轮状病毒亚单位VP6和NSP4与大肠杆菌热敏肠毒素LTB的B亚基佐剂融合，成功刺激了系统性和粘膜反应，血清IgG和粘膜IgA抗体的高滴度。其次，由于其最小的加工和制造要求，这项技术可以生产非常实惠的疫苗，从而有利于更全球化的可及性，因此扩大了保护范围。尽管自1990年以来已知疫苗抗原可以在植物中表达，但至今还没有植物疫苗进入市场，自1990年以来只有一种产品获得了FDA的商业化许可，作为兽用疫苗。尽管缺乏疫苗，已经在转基因番茄中生产了中和抗体。简而言之，食用植物作为重要的人类健康促进分子的来源，有着光明的未来，可以作为粗提取物或部分纯化的形式摄入。
使用与食品相关的微生物如酵母和乳酸乳球菌进行改良的方法也在小鼠模型中显示出免疫效果。
3.2.2. 通过注射途径给药的疫苗
由于之前提到的口服疫苗与肠道中的几种风险因素有关，如肠病，有时也与降低的免疫原性有关，大多数疫苗都是通过注射途径在儿童和成人中给药的。肌肉内给药已被证明在诱导免疫反应方面是安全有效的。因此，通过肌肉内给药的灭活RV疫苗将避免与口服疫苗相关的风险因素（包括前述的肠套叠和与疫苗相关的腹泻发作）。在这种情况下，目前正在开发几种注射用疫苗。注射用疫苗的一个可能的缺点是，在某些情况下，与减毒的粘膜疫苗相比，它们在诱导异种反应方面的能力可能有限。注射用疫苗避免了对口服活疫苗在肠道复制的需求。此外，它们的制造成本更低，运输更容易，因为它们在热稳定性上，从而进一步降低成本。这两种类型的疫苗已经在其他肠道感染，如脊髓灰质炎、伤寒或霍乱中成功生产。
亚单位疫苗这些疫苗的两个显著例子是NRRV P2-VP8-P[8]亚单位和P2-VP8-P[4]P[6]P[8]亚单位（图3），分别来源于RV刺突的VP8* P[8]和P[4]、[P6]和P[8]基因型的片段，与破伤风毒素的P2通用辅助T细胞表位融合。研究表明，在接种了三剂NRRV的儿童中，在接受最后一剂三价P2-VP8候选疫苗四周后，粪便中LORV Rotarix的排出减少了57%。此外，在南非儿童和婴儿进行的测试表明，接种疫苗的婴儿比服用安慰剂的婴儿显示出更强的IgG反应（>98%血清转化）。
类病毒颗粒几种疫苗基于使用VLP。芬兰坦佩雷大学正在研究一种基于VP6亚单位的疫苗，该疫苗结合了类似诺如病毒的颗粒（VLP），形成联合疫苗。初步结果表明，在免疫小鼠中诱导了强烈的系统性交叉反应的NoV和RV抗体反应，没有相互抑制任一抗原在组合中的免疫原性，表明了用单一疫苗注射来对抗两种不同的肠道病原体的可行策略。辛辛那提儿童医院医学中心还将VP8*亚域纳入了诺如病毒P（突出）和S（壳）亚病毒颗粒疫苗平台。使用这种嵌合体在小鼠中诱导了轮状病毒和诺如病毒中和抗体。最后，贝勒医学院开发了几种基于在杆状病毒中产生的VP2、VP4、VP6和VP7轮状病毒蛋白的VLP疫苗候选物，在小鼠、无菌小猪和兔子的不同动物模型中显示出积极效果。
灭活轮状病毒疫苗还开发了一种基于CDC9菌株的灭活RV疫苗（IRV），用于注射给药，触发异型反应以产生中和抗体。此外，这种疫苗与IPV结合正在开发中，以实现联合疫苗。我们发现了两个其他处于早期开发阶段的候选疫苗，一个包括一个灭活的G1P[8]菌株，以及一个基于LLR菌株（兰州羔羊）的截短VP4[8]。最后，还有一些正在开发中的疫苗信息较少，如MT-5625、热活化疫苗和病毒颗粒疫苗。
基于核酸的疫苗我们实验室的早期研究表明，在小鼠中，基于DNA的疫苗是合适的，并且可以有效对抗RV感染。核酸技术已经提升到了更高的水平，现在基于VP8*蛋白的mRNA疫苗正在进行临床前研究（Curevac AG）。
4. 疫苗中包含的RV基因型
关于疫苗配方中包含的基因型，如上所述，VP8* P[6]基因型在发展中国家由于这些人群中的基因型分布而具有额外的重要性，而且，在自然界中几乎所有的G基因型都观察到与P[4]、P[6]和P[8]基因型相结合，因此这三种P基因型的结合可以提供针对与它们相关的所有G基因型的高程度的保护性免疫。基于这些因素，几种疫苗候选物（CDC-6疫苗）和目前正在开发的疫苗在其配方中包含了P[6]基因型（如图3所示的三价注射用非复制性轮状病毒（NRRV）疫苗组）。此外，一些研究表明，当前菌株与最初培养或测序的菌株之间存在相当大的差异，并且随着时间的推移，这种差异在扩大。例如，在美国，所有具有P[8]基因型的菌株与原始Wa菌株之间的平均差异在1974年到1980年间增加了4%，在1988年至1991年间增加了5%，在2005年至2013年间增加了9%。这种变异是由点突变和重排事件引起的，并且可以观察到，近年来，这些事件由于疫苗的引入而受到青睐。沿着这些线索，其他研究报告了在比利时流通的VP8* P[8]基因型菌株之间的显著差异，那里的大多数属于第三谱系，与Rotarix（第一谱系）和RotaTeq（第二谱系）菌株形成对比。在印度、俄罗斯和日本等国家也记录了类似的结果。
5. 微针技术
近年来，使用微针贴片进行皮肤疫苗接种的趋势日益增长，正如在一项关于轮状病毒候选物的研究中所报告的。这些贴片具有许多优点：它们不需要冷链，可以由受过最少培训的人员应用（在发展中国家特别考虑），并且不产生危险的生物废物。一些研究已经提出这是一种可行的疫苗接种方法，因为这些疫苗的大规模生产可能是有利可图的，并且已经证明了这种产品的热稳定性适用于干燥疫苗。这些疫苗已经对不同的疾病进行了研究，如狂犬病、流感、乙型肝炎和脊髓灰质炎，显示出的主要优点是疫苗含量直接输送到表皮中的抗原呈递细胞，这可能导致所需剂量的数量减少，所需的抗原剂量降低，以及改善的疫苗诱导保护。对其他疾病使用微针的小鼠模型的研究表明，这些微针可以诱导与肌肉注射相当的流感免疫原性，仅使用当前剂量的三十分之一。此外，这项研究还表明，这些微贴片可以在23°C下至少存放6个月。
6. 结论
如上所述，自从疫苗引入以来，RV死亡人数已显著减少。然而，由于它们在LICs中的可及性不足和效力降低，仍然发生了许多潜在的可预防死亡。因此，正在进行不同的研究线路，其中包括新配方，例如目前正在开发的多种注射用疫苗，以避免使用口服疫苗引起的肠套叠病例。
最后，本文报告了两种新技术，它们的引入到RV疫苗中可以解决几个主要问题。首先，使用微贴片进行管理的疫苗不需要合格人员进行管理，并且具有高热稳定性；其次，使用食用植物作为疫苗将产生更便宜的疫苗，具有增强的全球可及性和更容易的管理。在这两个提议中，后者似乎是更远的现实，需要进一步研究。
