邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 (DEHP) 在环境和临床样本中广泛检测到，对内分泌稳态构成严重威胁。然而，目前还没有专门针对肝脏排泄 DEHP 来减轻其对内分泌系统有害影响的有效疗法。许多源自中药 (TCM) 的单体药物，如番茄红素和淫羊藿苷，以其抗氧化或抗炎特性而闻名，已被配制来减轻 DEHP 对肝脏和其他外周组织的损害。然而，这些药物只能缓解症状，而不能解决根本问题（DEHP 本身）。因此，消除DEHP在肝脏中的意外积累，同时减少其保留时间，可能会提供一种新的治疗策略，以消除DEHP对人类健康的负面影响。
2024年10月29日，中国药科大学陈思禹、刘畅、张雯翔共同通讯在EMBO Molecular Medicine（IF 9.0） 在线发表题为“Luteolin detoxifies DEHP and prevents liver injury by degrading Uroc1 protein in mice”的研究论文。该研究开发了一种Cy5修饰的靶向DEHP的单链DNA适配体，确定木犀草素是一种潜在治疗药物，它通过促进小鼠原代肝细胞和肝脏中DEHP的排出，表现出强大的DEHP解毒功效。通过进行广泛的网络药理学分析并利用高效的可视化csa -DEHP 平台，发现木犀草素是一种有效的治疗剂，可有效解毒小鼠肝脏中的 DEHP。从机制上讲，木犀草素可加速肝urocanate hydratase 1 (Uroc1) 的蛋白质降解。
木犀草素是一种强大的药物，通过靶向小鼠肝脏中的 Uroc1 来增强 DEHP 的解毒，从而为治疗由环境污染物（包括 DEHP 及其类似物）引起的疾病提供功能性策略。
•木犀草素促进肝脏对过量 DEHP 的解毒。
•Uroc1 是木犀草素的分子靶标。
•Ala270 和 Val272 是介导木犀草素诱导的 Uroc1 蛋白质降解的关键位点。
•Trans-UCA 作为 Uroc1 的底物，表现出与木犀草素相似的潜力。
摘要
邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一种环境污染物，广泛存在于环境和临床样本中，严重威胁内分泌系统稳态。DEHP在肝脏中蓄积明显，可导致肝脏损伤。由于缺乏有效的高通量筛选系统，阻碍了能够特异性靶向和消除DEHP有害影响的药物的发现。在这里，通过开发一种基于cy5修饰的单链dna适配子靶向DEHP的方法，确定木犀草素是一种潜在的药物，通过促进小鼠原代肝细胞和肝脏中DEHP的排出，显示出强大的解毒功效。机制上，木犀草素通过靶向作用于肝脏urocanate水合酶1 （urocanate hydratase 1, Uroc1）的Ala270和Val272位点，促进其蛋白降解。更重要的是，反式尿canic acid （trans-urocanic acid, trans-UCA）作为Uroc1的底物，通过抑制ERK1/2信号级联来调节溶酶体胞吐，具有类似木犀草素的特性。综上所述，木犀草素可通过调控UCA/Uroc1轴有效解肝脏DEHP毒性。
1.网络药理学分析具有肝脏清除过量DEHP能力的新药
从中药组方数据库（TCMP）和中药化学成分库（CCLCM）数据库（https://organchem.csdb.cn/scdb/main/tcm_introduce.asp）中提取128个解毒中药方剂，筛选新型解毒药物。具体的筛选标准和流程如图1A所示。筛选候选化合物的标准如下：口服可利用性(OB)≥30%，药物相似度(DL)≥0.18，半衰期≥4 h。按照这些标准，根据出现频率≥10次，共筛选出21种中药，通过中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP）系统分析，共获得387个有效的小分子化合物。对中药和常见有效化学成分进行维恩和拓扑分析，筛选程度≥3的有效成分，鉴定出减少DEHP蓄积的候选药物。如图1B所示，鉴定出一簇37个单体，而度数≥3的单体则有14个。
2.基于cy5标记的dna适配体的DEHP可视化和体外药物筛选策略
DEHP难以捉摸的特性给其检测带来了挑战，导致缺乏高效的高通量筛查技术。为了实现DEHP的可视化和实时跟踪，我们通过合成结合DEHP和Cy5探针的特异性DNA适配子来实现。首先，为了获得与DEHP特异性结合的DNA适配子，使用Capture-SELEX（通过指数富集的配体系统进化，systemic evolution of ligand by exponential enrichment）技术进行了体外选择，该技术涉及结合、分配和扩增的迭代过程（图1C）。经过10轮富集后，对PCR产物进行测序，最终选择了25个DNA适配子作为候选DNA(图1C)。为了实现可视化，我们通过在适体的羧酸基团和Cy5的氨基之间形成酰胺键将Cy5探针与适体连接。荧光光谱分析显示适配子-Seq.10-Cy5复合物在650 nm和670 nm处均出现吸收峰，与适配子和Cy5的吸收光谱重叠。在适配子光谱中，在3.4 ppm处的峰被表征为亚甲基的信号，而在1.9 ppm处观察到氨基的信号。对于csa-DEHP， DEHP的氢信号和适配子的氨基信号均被检测到。然而，氨基的信号被化学位移到2.3 ppm，这表明DEHP通过氢键与其适配子结合（图1C）。
为了证实7种单体对小鼠PHs中过量DEHP的解毒作用，将小鼠PHs暴露于csa-DEHP 12小时，然后在没有csa-DEHP的情况下与相应的药物孵育24小时。随后的激光扫描共聚焦显微镜（CLMS）分析显示，csa-DEHP的荧光信号随所有单体的出现而降低。其中，木犀草素表现出最强的降低DEHP在肝脏滞留的能力(图1D)。这一发现随后通过HPLC-MS分析进行了验证（图1E）。
图1 网络药理学分析具有肝脏清除过量DEHP能力的新药
2.木犀草素通过促进DEHP从小鼠肝脏排泄来解毒
重要的是，木犀草素以一种依赖于处理剂量和时间的方式减少了小鼠ph的DEHP积累(图2A)。此外，为了排除偏倚，比较了木犀草素对小鼠PHs中Cy5、适配体Cy5和环孢素a- dehp的荧光释放的影响。如图2B所示，木犀草素仅诱导csa-DEHP的荧光显著降低，而不改变Cy5或适配体-Cy5的荧光信号。HPLC-MS分析显示，木犀草素降低了小鼠肝脏、血清、尿液和白色脂肪组织中DEHP和MEHP （DEHP在肝脏中的代谢产物）的水平（图2C，D）。此外，木犀草素还减轻了dehp诱导的肝损伤，如木犀草素处理的小鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）水平降低所示（图2E）。木犀草素处理后，dehp诱导的巨噬细胞浸润减少（图2F，G）。木犀草素通过减轻dehp诱导的肾脏损伤，并同时降低dehp处理的小鼠肾脏中EMT生物标志物的蛋白表达，表现出与已证实的肝保护作用类似的肾脏保护作用。因此，我们的注意力和焦点已经转向木犀草素作为我们选择的解毒药物。
图2 木犀草素是一种潜在的抑制DEHP在小鼠肝脏蓄积的药物
3.肝脏Uroc1在转化水平对木犀草素治疗有反应
虽然木犀草素的有益作用已经成功建立，但其分子靶点仍不清楚。为了解决这个问题，我们使用小鼠ph样本进行了非标记蛋白质组学分析。这些肝细胞用DEHP处理12小时，然后在没有DEHP的情况下用木犀草素或0.1% DMSO处理12小时（图3A）。以P < 0.05且差异倍数≥1.5为标准筛选出差异表达蛋白。如图3B所示，木犀草素处理后，21个蛋白质簇发生了变化，其中9个上调，12个下调。随后，我们进一步分析了木犀草素对这些潜在靶点的分子对接能力，最终确定Uroc1具有最高的结合亲和力，这从其最低的S值可以看出(S =−7.12，图3C)。此外，DEHP对Uroc1在转录和翻译水平的表达均有一定的影响。另一方面，木犀草素对mRNA表达没有影响，但导致小鼠ph和肝脏的Uroc1蛋白水平分别降低了36.89%和39.90%（图3D-H）。重要的是，CHX追逐实验表明木犀草素加速了Uroc1的蛋白降解，导致半衰期缩短了31.7 h（图3I）。
图3 肝脏Uroc1在转化水平对木犀草素治疗有反应
4. 肝脏Uroc1是木犀草素的分子靶点
为了进一步阐明木犀草素降低Uroc1蛋白水平的机制，使用MG132（一种蛋白泛素化抑制剂）或Baf A1（一种自噬体-溶酶体介导的蛋白降解抑制剂）抑制蛋白降解途径。结果表明，MG132处理可以部分抑制木犀草素诱导的Uroc1蛋白降解，表明蛋白泛素化参与了这一降解过程（图4A）。进一步的分子对接分析预测木犀草素与Uroc1在Ala270和Val272位点结合（图4B）。为了确认Ala270和Val272位点的重要作用，我们将这些突变体转染到小鼠ph中，并对它们进行如上所述的类似处理。如图4C所示，当Ala270或Val272位点突变时，木犀草素诱导的Uroc1蛋白表达水平的降低被部分逆转，当两个位点都突变时，被完全逆转。因此，木犀草素处理导致Uroc1的泛素化增加，这一作用被Ala270或Val272位点的突变部分逆转，并被双突变体完全消除。
在功能上，Uroc1的过表达显著逆转了木犀草素诱导的小鼠ph中DEHP的释放。相比之下，当Uroc1的Ala270和Val272位点发生双突变时，上述重现被完全消除（图4D）。与这些结果一致，敲低Uroc1降低了小鼠ph中DEHP的积累，csa-DEHP的荧光信号减少证明了这一点（图4E）。一项体内研究表明，与经木犀草素处理的DEHP喂养小鼠相比，在腺相关病毒血清型8 （AAV8）介导的Uroc1过表达小鼠中，小鼠肝脏、血清和尿液中的DEHP和MEHP水平显著恢复（图4F、G）。同时，这些小鼠的血清AST和ALT水平也同样升高（图4H）。因此，在接受AAV8-Uroc1注射的小鼠的肝脏中观察到不期望的巨噬细胞浸润的类似恢复（图4I）。这些结果进一步强调了我们的结论，即Uroc1是木犀草素的特异性靶点，而Ala270或Val272位点是促进蛋白降解的关键氨基酸位点，从而促进了木犀草素诱导的Uroc1降解。
图4 肝脏Uroc1是木犀草素的分子靶点
5.反式uca是模拟木犀草素的功能代谢物
鉴于木犀草素存在多个分子靶点，并且考虑到针对Uroc1的新化学药物开发耗时且成本高昂，将重点放在与Uroc1相关的内源性代谢物上。由于Uroc1是催化反式uca转化为4-咪唑酮-5-丙酸盐的酶，因此Uroc1蛋白水平的降低导致其底物反式uca以及上游底物的增加（图5A）。我们发现，即使在DEHP存在的情况下，l -组氨酸（L-his）和反式uca对细胞活力都没有毒性。进一步基于csa-DEHP的CLMS分析发现，trans-UCA显著降低了csa-DEHP的荧光信号，而L-his则没有(图5B)。LC-MS分析进一步验证了这一发现。虽然L-his使DEHP含量降低了50.22%，但trans-UCA表现出与木犀草素相似的作用，使DEHP含量降低了84.48%（图5C）。因此，反式uca以一种既依赖于时间又依赖于剂量的方式减少了小鼠ph中的DEHP积累(图5D)。令人惊讶的是，反式uca在体内与木犀草素相当，并且降低了小鼠肝脏、血清和尿液中的DEHP和MEHP水平（图5E，F），同时也降低了DEHP诱导的血清AST和ALT升高以及巨噬细胞浸润（图5G，H）。
图5 Trans-UCA是模拟木犀草素的功能代谢物
6.erk1 /2介导的溶酶体通路参与介导木犀草素/反式uca促进的肝脏DEHP释放
为了研究介导反式uca信号的信号通路，我们使用小鼠肝细胞样本进行了无标记的蛋白质组学分析，这些肝细胞样本经DEHP处理12 h，然后在没有DEHP的情况下再用反式uca或PBS处理12 h（图6A）。以P < 0.05且差异倍数≥2为标准筛选出差异表达蛋白。经反式uca处理后，共有76个蛋白质发生改变，其中27个上调，49个下调（图6B）。GO分析表明这些蛋白聚集在MAPK通路上，尤其是与ERK1/2相关的通路（图6C）。DEHP显著提高了ERK1/2蛋白的磷酸化水平。相反，反式uca和木犀草素都表现出显著的逆转DEHP诱导的ERK1/2磷酸化的能力（图6D）。有文献表明，溶酶体相关途径是毒素和外源物质排泄的关键过程。由于这一途径受到ERK1/2蛋白的严格调控，假设ERK1/2调控的溶酶体途径是消除过量DEHP的关键途径。通过使用Baf A1，发现抑制溶酶体活性大大抵消了木犀草素和反式uca对肝脏清除DEHP的有益作用(图6E，F)。考虑到之前csa-DEHP的亚细胞分布，主要集中在溶酶体中，这个细胞器本身就是DEHP清除的重要机制。
图6 erk1 /2介导的溶酶体通路参与介导木犀草素/反式uca促进的肝脏DEHP排泄
结论
在这项研究中，我们证明了Uroc1作为一个治疗靶点具有巨大的潜力，可以有效地清除肝脏中的DEHP及其相关污染物。值得注意的是，木犀草素及其相关的内源性反式uca分别被确定为这一过程中的潜在功能药物和代谢物。
Federica Cappelli and Alessandro Mengozzi 评论：
Wang等人首先对中药单体药物进行了全面的网络药理学分析。他们从 128 个解毒配方中将范围缩小到 7 个单体，然后测试它们去除 DEHP 的能力。为此，他们开发了一种特定的方法来检测 DEHP，使用标记有 Cy5 荧光探针的基于单链 DNA 适体的方法。基于 DNA 适体的追踪系统具有创新性、高度特异性、出色的组织穿透性和卓越的体内安全性，使其成为追踪 DEHP 等小亲脂性分子的理想选择。建立该方法后，他们比较了 7 种单体对暴露于高浓度 DEHP 的原代小鼠肝细胞的功效，并将研究范围缩小到最有效的化合物——木犀草素。然后，他们在慢性邻苯二甲酸盐高暴露体内模型（即雄性 C57BL/6J 小鼠接受 10 毫克/公斤/天 DEHP 28 天）中测试了木犀草素 14 天治疗的功效。作者发现，木犀草素通过肝脏解毒对 DEHP 暴露发挥有益作用，显示出包括肾脏和脂肪组织在内的多个器官中 DEHP（及相关代谢物）水平的降低。木犀草素还可减少 DEHP 诱导的肝酶改变和肝巨噬细胞浸润。值得注意的是，木犀草素治疗还与肾脏保护作用有关，在这方面尤其重要，因为肾脏与肝脏一起负责从体内消除邻苯二甲酸盐。
木犀草素实现这种有益作用的机制是增加肝脏 Uroc1 的蛋白质降解，抑制反式UCA 转化为 4-咪唑啉酮-5-丙酸酯。反过来，较高水平的反式UCA会促进DEHP的溶酶体胞吐作用，从而促进有毒化合物的消除。木犀草素是一种以其抗炎和抗氧化特性而闻名的化合物。然而，在 DEHP 解毒的情况下，这两种效果很小。然而，不同的木犀草素特性的综合作用可能在邻苯二甲酸盐的背景下更为相关，并且也可能是作者观察到的肾脏保护作用的部分原因。最后，通过识别反式-UCA作为木犀草素介导的邻苯二甲酸盐去除的下游靶标，并证明其作为模仿木犀草素本身的功能代谢物的作用，它们为新的药理学方法提供了另一个潜在靶标。
在小鼠肝脏中，木犀草素通过泛素化 (Ub) 促进 Uroc1 降解，从而抑制反式UCA 向 4-咪唑啉酮-5-丙酸酯的下游转化。反式-UCA 然后作为一种功能性代谢物，促进 DEHP 溶酶体胞吐作用，从而从肝脏中清除有毒化合物并消除相关的肝损伤。
总之，Wang 等人的研究通过鉴定木犀草素及其内源性代谢物反式-UCA 作为具有去除邻苯二甲酸盐治疗潜力的化合物，为应对环境污染影响的艰巨挑战开辟了新的视角。尽管人类临床转化仍有待观察，但作者采用的严格和创新方法激发了人们的信心，并呼吁立即进行人类观察，为通过去除有毒物质来治疗污染暴露以预防与污染相关的疾病铺平了道路。
Wang H, Zhao Z, Song M, Zhang W, Liu C, Chen S. Luteolin detoxifies DEHP and prevents liver injury by degrading Uroc1 protein in mice. EMBO Mol Med. 2024 Oct 29. doi: 10.1038/s44321-024-00160-9.
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