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实验设计
结果
如图1A所示，根据超声心动图检测到的心功能，DLT减轻了高脂饮食联合LADCD引起的心肌损伤，模型组的射血分数（EF）和左心室短轴缩短率（FS）明显低于模型组和假手术组（p<0.01）。血脂水平通常被认为是冠心病的重要危险因素；根据图1D-G，DLT显著降低了总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白（LDL-C）水平，提高了高密度脂蛋白（HDL-C）水平（p<0.05）。随后，我们根据HE染色确定高脂肪饮食联合LADCD对缺血性心脏组织的损伤。DLT给药后，细胞体积不同程度减少，心肌细胞排列整齐，破裂现象下调，炎性细胞浸润也下调（图1H）。
图1 DLT可以预防高脂肪饮食联合LADCD引起的心脏功能障碍。A：高脂饮食中DLT给药与LADCD诱导的大鼠CHD模型的实验方案。B-C：通过超声心动图分析左心室EF%（B）和FS%（C）。D-G：DLT给药对血脂含量的影响，包括TC（D）、TG（E）、LDL-C（F）、HDL-C（G）。H：心脏组织切片HE染色（HE×400）。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与假手术组相比，#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比，△p<0.05，△△p<0.01（平均值±SE）。
本研究中，色谱系统和样品在蛋白质组学检测过程中具有良好的稳定性，方法结果可靠（补充图1）。我们成功建立了对照组、假手术组、模型组、DLT-L、DLT-M、DLT-H和阿托伐他汀组心肌组织蛋白的DDA谱库。DIA鉴定出4652种蛋白质和16384种肽（图2A和补充表1）。在筛选显著差异蛋白时，FC>1.5或FC<0.67和p<0.05被用作标准，以获得不同对照组中上调和下调蛋白的数量（图2B）。为了显示不同比较组之间蛋白质的显著差异，我们比较组中的蛋白质以火山图的形式显示（图2C-F）。对照组和模型组比较后获得的差异蛋白是CHD的潜在蛋白质生物标志物；这个案例被称为A。从DLT-L、DLTM、DLT-H和模型组获得的差异蛋白是DLT不同剂量组中可能与CHD相关的潜在蛋白质生物标志物；这个案例被称为B。从病例A和B的交叉点获得的差异蛋白是DLT治疗CHD的潜在差异蛋白。最后，我们共获得了27种潜在的差异蛋白，其中14种差异蛋白上调，包括ApoA2、KRT15、VMP1、ORM1、MRPL35、NAPEPLD、RNF31、KRT8、KRT10、TXN2、DUSP22、KNG1、KNG2和LARP1，其中13种差异蛋白下调，包括TAP2、TAP1、IFI47、PLS1、β-2M、EXOSC5、IGTP、MGC108823、GBP2、PXDN、TAPBP、PPT1和ENSRNOP0000085730（图2G和补充表2）。
每个亚细胞器中蛋白质的数量和分布比例如图3A所示。细胞外7例，细胞质9例，核质9例，线粒体4例，质膜4例。生物过程（BP）的主要显著富集的GO术语包括内源性和外源性肽抗原的抗原加工和呈递、通过MHCI类的肽抗原和内源性肽抗原、对干扰素的细胞反应、肽抗原以及抗原加工和递呈。内质网膜的基本和内在成分、角蛋白纤维、中间纤维、细胞器膜的整体和内在成分，中间纤维细胞骨架、肌动蛋白丝、CD40受体复合物和乳糜微粒是细胞成分（CC）的主要富集GO项。此外，分子功能（MF）的主要代表性GO术语是MHC类蛋白结合、GTP酶活性、多肽跨膜转运蛋白活性、肽抗原结合、二磷酸腺苷结合、鸟苷酸连接、嘌呤核糖核苷结合、嘌呤核苷结合和核糖核苷结合（图3B）。
KEGG通路富集结果显示，抗原加工和呈递、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）、人巨细胞病毒、原发性免疫缺陷病毒（HCMV）、非洲锥虫病、ABC转运蛋白、NOD样受体信号通路、单纯疱疹病毒-1（HSV-1）以及补体和凝血级联是最显著富集的术语（图3C）；其中TAP2/TAP1/β-2m/TAPBP在抗原加工和呈递、EBV感染、HIV-1感染和HSV-1感染中富集；TAP2/TAP1富集于HCMV感染和非洲锥虫病；KNG1/KNG2L1在ABC转运蛋白、补体和凝血级联中富集；RNF31/TXN2/GBP2在NOD样受体信号通路中富集（图3D）。
图3 DLT治疗冠心病大鼠潜在差异蛋白的功能注释分析。A：差异表达蛋白亚细胞定位分布饼图。B：基因靶点的GO富集分析。为每个功能类别确定了前10个富集项，横坐标表示富集得分，纵坐标表示BP、CC和CP的功能，BP用赭色标记，CC用深青色标记，MF用钢蓝色标记。C-D:KEGG途径富集分析。横轴表示基因比率，纵轴表示富集途径名称。色阶表示P值的不同阈值，点的大小表示与每个通路对应的基因数量。
在这项研究中，我们选择了三种富含NOD样信号通路的差异表达蛋白（RNF31、TXN2和GBP2）进行生物学验证。结果显示，与对照组和假手术组相比，模型组RNF31 mRNA和TXN2 mRNA水平显著降低，GBP2 mRNA水平显著升高（p<0.01或p<0.05）。与模型组相比，DLT-L、DLT-M、DLT-H和阿托伐他汀组的心肌组织表现出不同程度的回调（图4A-C）。蛋白质印迹法测量的蛋白质含量与mRNA水平显示出相同的趋势（图4D-F）。这些结果验证了蛋白质组学鉴定的差异蛋白。本研究引物信息如表1所示。
本研究进一步探讨了NLRP3炎性小体在CHD大鼠NOD样信号通路中的作用以及DLT如何发挥其作用。与对照组和假手术组相比，模型组心肌组织中P2X7R mRNA、HSP90 mRNA、TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA的表达水平显著升高（p<0.01或p<0.05）。与模型组相比，DLT-1、DLT-M、DLT-H和阿托伐他汀组大鼠心肌组织中P2X7R mRNA、HSP90 mRNA、TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA的表达水平显著降低（p<0.01或p<0.05）（图5A-E）。P2X7R、HSP90、TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达水平与mRNA水平呈相同趋势；与模型组相比，DLT-L、DLT-M、DLT-H和阿托伐他汀组大鼠心肌组织中P2X7R、HSP90、TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达水平显著降低（p<0.01或p<0.05）（图5F–J）。
图5 DLT治疗CHD大鼠心肌组织NLRP3炎性小体的启动步骤。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与假手术组相比，#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比，△p<0.05，△△p<0.01（平均值±SE）。A-E:P2X7R mRNA、HSP90 mRNA、TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA表达的RT-PCR。F-J:P2X7R、HSP90、TLR4、MyD88和NF-κB p65表达的蛋白质印迹。
与对照组和假手术组相比，模型组心肌组织中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-18 mRNA和IL-1βmRNA的表达水平显著升高（p<0.01或p<0.05）。与模型组相比，DLT-L、DLT-M、DLT-H和阿托伐他汀组大鼠心肌组织中NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-18 mRNA和IL-1βmRNA的表达水平均有不同程度的降低（p<0.01或p<0.05）（图6A-E）。免疫印迹法测定的NLRP3、ASC、Caspase-1和Pro-Caspase-1的蛋白质含量（图6F-I）以及ELISA法测定的IL-18和IL-1β的蛋白质含量与mRNA水平呈相同趋势（图6J-K）。
图6 DLT治疗CHD大鼠心肌组织中NLRP3炎性小体的活化步骤。与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；与假手术组相比，#p<0.05，##p<0.01；△与模型组相比，p<0.05，△△p<0.01（平均值±SE）。A-E:RT-PCR检测NLRP3 mRNA、ASC mRNA、Caspase-1 mRNA、IL-18 mRNA和IL-1βmRNA的表达。F-I:NLRP3、ASC、Caspase-1和Pro-Caspase-1 p65表达的蛋白质印迹。J-K:ELISA法检测IL-18和IL-1β的表达。
结论
在这项研究中，结果表明DLT显著减轻了心脏功能障碍，并降低了高脂肪饮食联合LADD引起的心肌细胞死亡率。令人信服的实验证据支持我们探索DLT激活NLRP3炎性体信号通路治疗CHD的深入药理学机制。本研究创新性地提出，DLT通过抑制P2X7R表达进一步发挥抗心肌损伤作用，从而干扰HSP90调节的NLRP3炎性体的启动（TLR4/MyD88/NF-κB）和活化（NLRP3/ASC/Case-1），进而减少IL-1β和IL-18炎性因子的释放（图7）。我们的研究结果阐明了DLT的一种新机制，并为CHD提供了一些新的药物评估靶点和治疗策略。
本研究创造性地使用DIA的无标记定量分析方法，鉴定了DLT治疗CHD中27种核心差异表达蛋白。通过生物信息学分析，我们观察到这些蛋白质的生物学功能在抗原加工和呈递、EBV感染、HIV-1感染、HSV-1感染、HCMV感染、非洲锥虫病、ABC转运蛋白、补体和凝血级联以及NOD样受体信号通路中显著富集，这进一步证实了DLT对CHD的治疗作用是一种多靶点、多途径的治疗。我们进一步关注了DLT的抗炎机制。NOD样受体是宿主中的一类模式识别受体，参与先天免疫反应，调节炎性小体的产生，并参与炎症反应。此外，关键蛋白（RNF31、TXN2和GBP2）验证了蛋白质组学结果。其中，RNF31主要参与免疫功能。泛素化修饰可以通过IL-1受体或TLR介导信号转导。当RNF31的表达水平降低时，它会抑制TNF-α刺激的NF-κB的转录活性，减少下游炎症相关因子的表达，促进细胞凋亡。RNF31介导的锌指蛋白A20泛素化通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在炎症通路的激活中起着关键的调节作用。TXN2在控制线粒体活性氧的稳态、调节细胞生长和抑制凋亡方面起着关键作用。过量的mtROS激活NF-κB信号传导并触发NLRP3炎性小体激活。一项研究强调TRX2-mtDNA-NLRP3炎性小体是整合氧化应激、炎症和全身代谢稳态的关键枢纽。利伐沙班通过抑制TXNIP/TRX2相互作用改善血管紧张素II诱导的心脏重塑。GBP2是一种干扰素（IFN）诱导的蛋白质，在宿主防御细胞内病原体感染中起着重要作用。在细菌感染期间，GBP2支持激活含有Caspase-1的炎性小体复合物，从而引发焦亡。此外，在没有先前TLR刺激的情况下，GBP依赖性快速动力学炎症小体激活可以驱动IFN-γ诱导的NLRP3炎症小体快速促进IL-1β和IL-18的分泌。本研究结果表明，DLT可以通过增加RNF31和TXN2的表达水平，降低GBP2的表达水平来改善CHD大鼠的心脏功能，并作用于NOD样受体信号通路，这与NLRP3炎性体的启动和激活密切相关。
NLRP3是炎症和程序性细胞死亡之间的联系，在AS的病理机制和药物开发中得到了广泛的研究。P2X7R通过激活NLRP3炎性小体引起炎症介质的释放，在整个炎症反应中起着重要作用。NLRP3炎性小体在激活前被HSP90自身抑制。因此，HSP90保护NLRP3蛋白合成复合物免受降解。细胞外病原体相关分子模式（PAMP）或损伤/危险相关分子模式（DAMP）可以解除抑制状态并促进NLRP3炎症小体的激活。经典的NLRP3炎性体激活途径包括两个阶段：启动和活化，涉及各种炎症反应。在NLRP3炎性体的启动阶段，TLR4识别PAMPs或DAMPs，通过MyD88激活NF-κB，并增加NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达水平。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是AS易损斑块免疫和抗炎反应的关键途径。TLR激活后可分为Myd88介导的信号通路和Myd88非依赖性信号通路。MyD88依赖途径的关键环节是NF-κB的激活，以调节基因转录，并参与炎性细胞趋化、细胞粘附和细胞外基质降解的病理过程。TLR4/MyD88/NF-κB通路和NLRP3炎性小体可以介导心肌缺血性梗死损伤的炎症反应。葛根素和丹参酮IIA可以通过TLR4/Myd88/NF-κB抑制NLRP3炎性小体，保护大鼠心肌免受IR损伤。我们之前的体内研究表明，DLT乙醇提取物对ox-LDL诱导的RAW 264.7巨噬细胞抗炎活性的干预可能与MyD88/p38 MAPK/NF-κB信号通路有关。在NLRP3炎性小体的激活阶段，核心蛋白NLRP3、衔接蛋白ASC和效应蛋白Caspase-1组装成细胞质多蛋白复合物，参与各种炎症反应。PAMPs和DAMPS可以结合并激活NLPR3，形成NLRP3/ASC/Pro-Caspase-1炎性小体，进一步催化Pro-Caspase-1的自水解形成具有酶活性的Caspase-1。此外，Pro-IL-1β和Pro-IL-18被切割成炎症因子，如IL-1β和IL-18，分泌到细胞外空间引起炎症反应。因此，DLT对CHD大鼠AS的干预作用可能与TLR4/MyD88/NF-κB通路的启动和NLRP3/ASC/Pro-Caspase-1通路的激活有关。
结论
DLT可增加CHD大鼠心肌组织中RNF31和TXN2的mRNA和蛋白质表达水平，降低GBP2的mRNA和蛋白表达水平，作用于NOD样受体信号通路以减轻心肌损伤，改善心功能。具体的调控机制可能是通过下调P2X7R表达，从而干扰HSP90调节NLRP3炎性体的启动（TLR4/MyD88/NF-κB）和活化（NLRP3/ASC/SCaspase-1）步骤。NLRP3炎性小体可以下调IL-1β和IL-18炎性因子的释放，在抗心肌损伤中发挥作用。简而言之，我们对DLT机制的研究为DLT的药效机制提供了新的见解，并为CHD提供了潜在的治疗靶点。
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