本文转自：高效给药
糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的主要并发症，目前尚无治疗干预措施。石杉碱甲（Hup A）是一种天然生物碱，具有显著的降血糖和抗炎作用。在本研究中，作者利用转录组、代谢组、微生物组和网络药理学进行联合分析，检测了Hup A对DN的影响，并进一步在糖尿病患者、db/db小鼠和细胞水平上验证差异基因，最终发现Hup A的干预可减轻DN大鼠肾损伤，实验结果提示通过调节脂质代谢、微生物稳态和细胞凋亡可有效治疗DN。
本文“Huperzine A as a potential therapeutic drug for diabetic nephropathy: Insights from transcriptome, metabolome, microbiome, and network pharmacology analysis”由浙江大学医学院附属儿童医院等研究团队于2024年10月发表于Pharmacological Research杂志。
研究背景
DN是糖尿病的主要并发症，是世界范围内终末期肾病的主要原因，目前尚无治疗方法[1]。DN的特征包括高血糖和高脂血症引起的肾功能下降，典型特征为蛋白尿和肾小球滤过率降低[2]。DN的主要病理机制包括代谢紊乱、氧化应激、细胞凋亡、纤维化、炎症细胞浸润和毛细血管损伤[3]。这些代谢途径与肠道功能密切相关，DN的微生物群与非糖尿病患者有显著差异[4, 5]。因此，控制血糖水平、调节脂质代谢和保护肾脏结构是预防和治疗DN的有效策略。
Hup A是一种从蛇足石杉中提取的生物碱，具有乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂的神经保护作用，如阿尔茨海默病、帕金森病[5]。最近的研究表明，Hup A具有多种生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡和线粒体保护作用[7]。糖尿病和神经退行性疾病有许多共同的药物靶点[8]。作者前期的研究也证实了Hup A在2型糖尿病大鼠模型中的视网膜神经保护作用和降糖作用[9]。此外，Hup A可改善2型糖尿病小鼠肥胖相关的认知功能障碍[10]。结合中医的“经络趋向性”，Hup A主要与肝和肾相关，而高血糖是DN的重要因素。因此，作者想要探究Hup A是否对DN具有保护作用。
在这项研究中，作者通过评估血糖水平、肾功能指标和组织学的改变，确定了Hup A对DN大鼠的缓解作用。为了评估Hup A对DN的保护机制，作者对大鼠肾脏进行转录组学和代谢组学分析，对大鼠粪便进行微生物组学分析。本研究阐明了Hup A治疗DN的作用机制。网络药理学分析和生化实验进一步验证了作者的发现。作为一种潜在的DN治疗药物，作者的研究揭示了Hup A如何改善DN，为Hup A的机制提供了理论和实验支持。
二、研究结果
Result 1 分Hup A减轻DN大鼠肾损伤
作者采用考马斯亮蓝染色法测定各组大鼠肾脏尿蛋白含量。结果显示，Hup A治疗能够显著降低尿蛋白含量（图1A-B）。同时，Hup A治疗后肾脏指数明显下降（图1C）。DN组大量蛋白尿导致的高肾小球滤过可能与低Scr水平有关（图1D）。三组间BUN差异无统计学意义（图1E）。此外，作者对大鼠肾组织进行H&E和Masson染色，评价Hup A处理对DN大鼠的组织学和形态学影响（图1F）。H&E染色显示DN组肾小球基底膜增厚，系膜基质增加，肾小管空泡化。Masson染色显示DN组肾小球内纤维化病变，小管腔及间质纤维化改变。此外，Hup A治疗还明显减轻了肾小球和肾小管的损伤（图1G）。作者采用Western blotting进一步测定nephrin和podocin蛋白水平。如图1H所示，DN组nephrin和podocin均显著下调，而Hup A处理逆转了nephrin和podocin的下调。
作者还通过体外CCK8试验评估了Hup A的细胞毒性作用。首先，作者检测了不同浓度的Hup A对细胞活力的影响。结果表明，即使在200 μM的高浓度下，Hup A也不会显著影响细胞活力，表明其具有良好的安全性。此外，1 μM Hup A治疗可降低炎症水平。这与作者早期在大鼠模型中发现的Hup A的抗炎作用一致。
为了评估Hup A在体内的潜在副作用，作者纳入第四个实验组（NC+Hup A，n=5），接受与NC组相同的治疗，但给予Hup A。治疗一个月后，与NC组相比，肝脏或肾脏功能参数或体重没有明显变化。与NC组相比，NC+Hup A组血糖水平略有下降，但差异无统计学意义。这些结果，结合以往研究的大量临床安全性数据，进一步支持了Hup A给药的安全性。
图1.Hup A对DN大鼠肾脏的影响
（A）尿蛋白考马斯亮蓝G250染色。（B）ELISA试剂盒检测大鼠uALB。（C）肾脏指数：肾脏重量/大鼠体重。（D）三组的Scr值。（E）BUN水平。（F）H&E和Masson染色的代表性肾脏切片。蓝色箭头：肾小球基底膜增厚，黑色箭头：肾小球系膜基质增加。（G）量化肾小球直径、肾小球硬化率、小管损伤评分，观察肾小球肥大及肾损伤情况。（H）大鼠肾脏Nephrin和Podocin的相对蛋白水平及定量分析。
Result 2 Hup A治疗对肾脏转录组的影响
为了深入研究Hup A治疗DN的分子机制，作者进行了转录组测序并分析了差异表达基因（DEGs）。如图2A所示，与DN相比，作者在NC中发现了444个DEGs，其中255个下调，189个上调。与Hup A+DN组相比，DN组出现了81个DEGs，包括33个下调基因和48个上调基因（图2D）。与Hup A+DN相比，NC共鉴定出502个DEGs，包括283个下调基因和219个上调基因。值得注意的是，在DN组中观察到Apoe和Apoc2的显著上调，并且在Hup A处理后这种上调显著降低。
作者通过GO分析来描述DN和Hup A处理诱导的显著功能性DEGs。如图2B所示，NC和DN主要富集肾脏发育、肾系统发育、肾元发育和脂质代谢过程。与DN+Hup A相比，DN组学习记忆和脂质代谢（脂肪酸代谢过程、低密度脂蛋白颗粒、高密度脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒、脂蛋白颗粒）富集。KEGG通路富集分析结果如图2C所示。与DN组相比，NC组糖尿病并发症的PPAR信号通路和AGE-RAGE信号通路明显富集。其中，在NC与DN和DN与DN+Hup A的比较中，脂质代谢过程被富集，表明Hup A处理对DN大鼠脂质代谢有显著影响（图2E-F）。
图2.Hup A对肾脏转录组的影响（n=3）
（A）NC组和DN组之间DEGs的火山图。（B）NC组和DN组之间DEGs的GO富集分析。（C）NC组和DN组之间DEGs的KEGG通路富集。（D）DN和DN+Hup A群之间的DEGs火山图。（E）DN和DN+Hup A组间DEGs的GO富集分析。（F）DN和DN+Hup A组之间的DEGs的KEGG通路富集。
Result 3 Hup A治疗对肾脏代谢组的影响
作者采用非靶向代谢组学分析研究肾脏代谢变化。NC组和DN组的样品具有明显的分散性，而DN+Hup A的分布更接近NC组。提示Hup A治疗能恢复DN大鼠的代谢。NC组和DN组之间的比较显示36种代谢物差异调节，34种代谢物上调，2种代谢物下调。值得注意的是，鞘氨醇、16(R)-HETE和花生四烯酸在DN组中显著上调，而在Hup A处理后，鞘氨醇和16(R)-HETE显著下调，说明这些物质可能参与了Hup A治疗DN的机制（图3A）。
随后通过对比KEGG通路数据库，作者确定了相关的疾病通路、代谢通路和信号通路。图3B显示了前25条富集的疾病通路，包括慢性肾功能衰竭、慢性肾脏疾病和衰老相关代谢物，这表明Hup A在DN中具有保护作用。图3C显示了前20个富集的代谢途径和信号通路，主要是花生四烯酸代谢、凋亡和PPAR信号通路。因此，Hup A对DN的缓解作用可能与这些途径有关。
图3.Hup A对肾脏代谢物的影响（n=3）
（A）差异代谢物火山图。（B）KEGG分析中前25个富集的疾病通路。（C）KEGG分析中最富集的25条代谢途径和信号通路。
Result 4 Hup A治疗对肠道微生物组的影响
作者采用16S rRNA测序评估Hup A处理对肠道菌群的影响。作者在多个时间点（第0天，第50天和第100天）收集粪便样本，以跟踪肠道微生物群在DN进展过程中的动态变化。其中，第100天的发现最为关键，图4A显示，Shannon多样性指数在DN组中降低，而在DN+Hup A组中增加，这表明Hup A处理促进了微生物群的多样性。图4B显示了部分优势菌群。如图4C所示，Hup A处理使Ruminococcus和Colidexibacter属的丰度增加，在DN组中减少，而使链球菌、Phascolarctobacterium、肠球菌、Blautia和Escherichia-Shigella属的丰度减少，在DN组中增加。
此外，作者构建了优势种网络来阐明不同微生物之间的相互作用，红线表示正相关，绿线表示负相关（图4D）。在NC组中，乳酸杆菌的丰度非常高。相比之下，葡萄球菌和Phascolarctobacterium的丰度极低。有趣的是，葡萄球菌和Phascolarctobacterium与乳酸杆菌呈负相关。在NC组中，Blautia的丰度也极低，但与乳酸菌呈正相关。此外，作者将16S测序结果与KEGG和MetaCyc数据库相结合进行功能预测。图4E显示了KEGG预测的二级功能通路，其中氨基酸、碳水化合物和脂质代谢显著富集。图4F显示了MetaCyc预测的二级功能通路，其中氨基酸生物合成、脂肪酸和脂质生物合成以及糖酵解的富集显著。这些结果表明，Hup A可能通过调节肠道菌群组成和涉及碳水化合物、脂质和氨基酸的关键代谢过程来发挥DN保护作用。
图4.Hup A对肠道菌群的影响及途径分析（n=3）
（A）第100天Shannon指数。（B）优势微生物（门级）。（C）物种组成热图（属级）。（D）优势物种子网络图和分组丰度饼状图。（E）KEGG通路分析。（F）MeataCyc通路分析。
Result 5 微生物组、代谢组和转录组的综合分析
为了阐明DEGs与代谢物之间的联系，作者对代谢组和转录组进行了Spearman相关分析（图5A）。作者特别关注Hup A治疗后显著下调的关键基因（Apoe和Apoc2）与脂质代谢生物标志物（鞘氨醇、16(R)-HETE和花生四烯酸）之间的相关性。结果表明，Apoe、Apoc2、花生四烯酸和鞘氨醇与16(R)-HETE呈显著正相关，而Apoe、Apoc2和鞘氨醇之间无显著相关。
代谢组和微生物群进行Spearman相关分析，以确定代谢物与微生物群组成（属水平）之间的关系。作者注意到鞘氨醇、16(R)-HETE、花生四烯酸和不同微生物群之间的相关性。如图5B所示，花生四烯酸与葡萄球菌呈显著正相关。鞘氨醇和16(R)-HETE与肠球菌呈显著正相关，与链球菌、Phascolarctobacterium、Blautia和Escherichia-Shigella呈显著正相关，与Ruminococcus和Colidexribacter呈负相关。通过针对鞘氨醇的质谱检测，作者发现经Hup A处理后，DN中鞘氨醇含量升高，恢复到对照水平（图5C）。
图5.转录组、代谢组和微生物组的相关性分析
（A）差异基因与代谢物的Spearman相关分析。（B）属水平上差异代谢物与肠道微生物群的Spearman相关分析。（C）大鼠肾组织鞘氨醇水平的靶向验证。
Result ６生物医学实验验证
为了进一步探究在更多样本中的情况，作者在大鼠和小鼠疾病模型、临床DN样本和高血糖细胞模型中均进行了验证。首先作者通过qRT-PCR验证了Apoe和Apoc2的mRNA水平，并通过WB验证了糖尿病大鼠肾组织中Apoe的蛋白水平，结果与转录组学数据一致（图6A-B）。此外，Apoe和Apoc2的免疫荧光染色在糖尿病大鼠、db/db小鼠组、糖尿病肾病患者肾小球和肾小管中均表现为高信号（图6C、E、F）。Hup A处理后，大鼠肾组织切片荧光信号减弱（图6C），高糖肾细胞模型中也出现同样的趋势（图6D）。
QP和WB对si RNA效率的验证见图7E-F。此外，细胞模型中的si-Apoe可以改善高糖引起的炎症状态（图7G）。作者进一步检查了大鼠的血脂水平，发现Hup A可以改善糖尿病大鼠的高甘油三酯血症。综上所述，这些实验数据证明了Apoe在Hup A对DN的保护作用中的作用。
图6.多组学数据的多级验证
（A）Apoe和Apoc2 mRNA在糖尿病大鼠模型中的表达。（B）大鼠肾脏中Apoe和Apoc2的相对蛋白水平及定量分析（n=3）。（C）大鼠肾脏组织切片中Apoe（红色）和Apoc2（绿色）的免疫染色。（D）高血糖和Hup A处理后足细胞中Apoe和Apoc2基因的mRNA表达。（E）db/db模型小鼠Apoe（红色）和Apoc2（绿色）的免疫荧光染色。（F）临床糖尿病肾病患者肾小球和肾小管中Apoe和Apoc2的免疫荧光检测。
Result 7 临床评估
了解Apoe与DN相关生物标志物的临床相关性对于评估其在临床实践中的适用性以及评估Hup A作为治疗方案的可行性至关重要。为了弥补这一空白，作者分析了Apoe表达与DN患者各种临床生物标志物之间的关系。共纳入428例DN患者进行进一步分析（图7A）。这些数据说明了临床生物标志物与Apoe表达水平之间的关系。
作为血糖控制水平的指标，HbA1c与Apoe呈正相关，说明Apoe的表达随着HbA1c水平的升高而升高。在肾功能方面，高蛋白尿时Apoe表达与24 h尿蛋白水平呈强正相关，提示随着蛋白尿的升高，Apoe表达也随之升高。Apoe与EGFR、UAER、Scr的相关性较弱，无统计学意义。ALB与Apoe呈显著的非线性相关（图7B）。
由于Apoe是脂质代谢的关键角色，作者也研究了Apoe表达与脂质谱的关系。结果显示，Apoe的表达与脂质相关的生物标志物，包括TG、HDL-C、LDL-C、胆固醇、ApoAI和ApoB之间存在显著的正相关（图7C）。随着这些脂质生物标志物水平的增加，Apoe表达水平也趋于增加，其中大多数关系具有统计学意义。
作者还研究了Apoe和炎症标志物之间的关系，特别是CRP和HsCRP。结果表明，Apoe表达与HsCRP水平之间存在显著的整体相关性，并存在显著的非线性关系。通过小提琴图来可视化四组HsCRP中Apoe的表达（图7D）。分析表明，Apoe的表达从最低到最高HsCRP组逐渐增加，部分组间差异显著。这些发现强调了不同炎症水平下Apoe表达的动态变化。
Result 8 Apoe基因敲除的影响
为了研究Apoe在DN中的作用，作者使用si-Apoe转染HPC，通过qRT-PCR和Western blot分析证实其敲低效率（图7E-F）。结果显示，Apoe敲低导致炎症减少，细胞粘附增加，细胞活性升高（图7G-I）。Western blot分析显示，与NC组相比，si-Apoe组自噬体标志物LC3B II/LC3B I蛋白表达明显降低，说明葡萄糖诱导了更高的自噬水平，而si-Apoe降低了自噬水平。另一种源于自噬的maker Beclin-1也表现出葡萄糖处理后较低，而siApoe处理后较高的趋势。此外，由于LC3B I螯合p62聚集体，自噬受损时p62聚集，而实验结果显示si-Apoe后足细胞中的p62聚集体增多。这些实验结果一致表明APoe敲低后HPC自噬水平降低（图7J），故而可推测Hup A是通过调节Apoe表达来防止过度自噬和细胞凋亡来减轻这些影响的。
图7 Apoe与临床生物标志物的相关性及Apoe基因在细胞模型中的作用机制验证
（A）临床工作流程图。（B）肾功能与Apoe水平的相关性。（C）血脂与Apoe水平的相关性。（D）炎症与Apoe水平的相关性，以及Apoe水平与HsCRP升高的相关性。（E）western blot分析Apoe沉默效率。（F）qRT-PCR分析Apoe沉默效率。（G）敲除Apoe基因后高血糖细胞模型的炎症水平。（H）敲除Apoe基因后高血糖细胞模型足细胞粘附。（I）敲除Apoe基因后高血糖细胞模型足细胞活性。（J）敲除Apoe基因后高血糖细胞模型足细胞自噬。
Result 9 网络药理学分析
通过网络药理学寻找Hup A和DN靶点蛋白的交集，作者发现了33个共同靶点，并用于进一步分析。为了进一步探索Hup A与DN靶蛋白之间的相互作用，作者将获得的33个共同靶点导入STRING数据库，构建包含33个节点和145条边的PPI网络。结果表明，凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2和Caspase3）可能是DN的潜在靶点。基于11种算法的网络模型拓扑分析进一步确认了上述关键靶点。
利用GO和KEGG途径富集分析药物-疾病靶点，探讨Hup A治疗DN的潜在分子机制。其中，BP项主要包括细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应和对外源刺激的反应。MF项主要包括伴侣结合、内肽酶活性、蛋白酶结合和丝氨酸水解酶活性。CC项为内质网管腔、膜微域、膜筏和孔复合物。此外，前20条富集的KEGG通路中包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞凋亡、鞘脂信号通路和细菌感染，提示了Hup A治疗DN的潜在机制。作者检测了肾组织中Bcl-2和Bax的蛋白水平，这两种蛋白在细胞凋亡过程中起重要作用。结果显示DN组细胞凋亡明显高于NC组。而Hup A处理在mRNA和蛋白水平上降低了Bax/Bcl-2的比值，表明Hup A处理通过控制细胞凋亡来改善DN。
三、小结
DN是糖尿病的严重并发症，是肾衰竭的主要原因，并显著提高患者死亡率。前期研究发现Hup A对糖尿病大鼠具有显著的降糖和抗炎作用。然而，其更广泛的保护作用，特别是对肾功能的保护作用，仍未得到充分研究。为了解决这个问题，作者采用了多组学方法，整合转录组学、代谢组学、肠道微生物组分析和网络药理学，来阐明Hup a影响DN的分子机制。结果发现，Hup A通过调节转录组、代谢组和微生物群的反应，在减轻DM诱导的肾损伤、脂质代谢紊乱和炎症方面显示出良好的治疗效果。结合肾脏转录组和代谢组分析进一步发现，Hup A主要改变脂质代谢关键基因Apoe和Apoc2的转录水平，并调节脂质代谢标志物鞘氨醇、16(R)-HETE和花生四烯酸的丰度。此外，Hup A有效改善了DN引起的肠道菌群失调。Spearman的相关分析显示，脂质代谢标志物与肠道微生物群相关。本研究首先详细评估了多种模型（糖尿病大鼠、糖尿病小鼠、糖尿病患者、高血糖细胞模型）中Apoe和Apoc2在DN中的表达，提示Hup A可能通过调节Apoe表达参与DN的保护。临床数据显示Apoe作为DN的生物标志物和潜在靶点的潜力。细胞水平的研究进一步阐明了Apoe基因敲低对足细胞的保护作用。
作者的研究结果也为进一步研究Hup A的适应症和用法奠定了基础，但本研究仍有一些局限性。较小的肾脏组织样本量限制了统计能力，特别是考虑到肠道微生物群和代谢的固有变异性，这可能导致假阴性。此外，各种组学数据之间的逻辑集成不像期望的那样强。为了解决这个问题，作者用大型临床数据集和基因敲低实验来补充发现，以加强结论。展望未来，开展纵向研究监测DN患者Apoe水平和临床生物标志物的动态变化将是至关重要的。此外，为了充分确定Hup A的治疗潜力，进一步验证该多组学数据是必要的。
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原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661824003372#fig0035
DOI：10.1016/j.phrs.2024.107392
指导老师：狄留庆、张雯
排版编辑：柴晓倩、王萍
稿件审阅：张雯
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