栎樱酸(RBA)是从龙胆科-秦艽分离得到的天然产物。抗骨关节炎、抗炎、复发性TNF相关疾病等生物活性强,是东南亚治疗RA的一种草本植物。然而,它还没有在RA模型中进行测试,其功能机制尚不清楚。
2023年7月28日，四川大学张凌团队在Signal Transduction and Targeted Therapy在线发表了题为“Metabolic reprogramming of proinflammatory macrophages by target delivered roburic acid effectively ameliorates rheumatoid arthritis symptoms”的研究论文，该研究揭示靶向递送的栎樱酸（roburic acid，RBA）对促炎巨噬细胞的代谢重编程有效改善类风湿性关节炎(RA)症状。首次发现了RBA在RA治疗中的作用机制，并表明ERK/HIF-1α/GLUT1通路可能是一个有前景的RA治疗靶点。
摘要
类风湿关节炎(RA)是一种常见的慢性炎症性疾病。研究发现，栎樱酸(RBA)是抗类风湿药大叶秦艽的一种成分，表现出较强的抗炎活性。但其疏水性、缺乏靶向性、作用机制不清等限制了其在医学上的应用。在这里，我们构建了一个pH响应的双靶点药物递送系统(RBA- nps)， RBA- nps靶向CD44和叶酸受体，并研究了其药理学机制。在大鼠RA模型中，与游离RBA相比，纳米载体有效地将RBA递送到炎症部位，显著提高了治疗效果，并显著降低了炎症细胞因子水平，促进了组织修复。随后的分析表明，关节中的M1型巨噬细胞被RBA重编程为M2表型。由于促炎巨噬细胞和抗炎巨噬细胞的平衡在维持RA免疫稳态和防止过度炎症中起重要作用，这种重编程可能是抗RA效应的原因。此外，我们发现RBA-NPs通过阻断ERK/HIF-1α/GLUT1通路来下调糖酵解水平，从而驱动m1向m2表型转换。因此，我们的工作不仅开发了一种靶向递送系统，显著提高了RBA的抗ra效率，而且确定了一个潜在的分子靶点，通过调节能量代谢来反向重编程巨噬细胞。
1.NPs和RBA-NPs的制备和表征
PAE-HA-FA共聚物主要通过Michael-addition聚合和酰胺酯反应合成。PAE-HA-FA为白色半透明块状固体，熔点为160 ~ 161℃，分子量为12000，产率为89%。所得产物PAE-HA-FA接枝共聚物的化学结构通过FT-IR、1H-NMR波谱和13C-NMR波谱进行了确认。制备的共聚物可以自组装成纳米胶束，用于RBA的靶向递送(图1a, b)。负载RBA的FA-HA-PAE纳米粒(RBA-NPs)和空白的FA-HA-PAE纳米粒(NPs)均采用超声法制备。透射电子显微镜(TEM)图像显示，空白NPs和RBA-NPs大致呈球形，大小均匀(图1c, d)。通过DLS测量，空白NPs和RBA-NPs的粒径约为174.2 nm和249.4 nm(图1e, f);空白NPs和RBA-NPs的zeta电位分别为−19.9 mV和−17.6 mV(图1g, h)。获得的FA-HA-PAE纯度为97.29%，可用于后续实验。RBA-NPs的包封率和载药量分别为84.2±1.3%和9.6±0.8%。
由于PAE核心的设计是在低pH条件下降解，在体外测试了不同pH条件下聚合物胶束对RBA的累积释放率和空白胶束的粒径。用pH值为7.4、6.8和5.0的PBS缓冲液分别模拟正常生理状态、RA关节微环境和细胞溶酶体情况如图1i所示，在pH 7.4条件下，RBA- nps相对稳定，RBA释放速率缓慢，24小时释放~14% RBA, 72小时释放~17% RBA，没有明显的突释。在pH为6.8时，24 h释放约50% RBA, 72 h释放约59%;在pH为5.0时，RBA泄漏进一步加快，24 h释放约71%，72 h释放约82%。纳米胶束在pH值7.4孵育24 h后稳定，在pH值6.8和5.0时，胶束尺寸显著增加(图1j)。因此，成功地制备了具有指定pH敏感性的rba纳米胶束。
图1 空白NPs和RBA-NPs的制备和表征
2.RBA-NPs在体外和体内均表现出靶向性
然后对制备的纳米载体的靶向性进行了检测。在这里，使用1,1'-双十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚二碳青氨酸(DiD)代替RBA作为标记物(DiD- nps)，来标记细胞对纳米胶束的摄取以及在动物中的荧光定位首先，体外培养RAW264.7细胞和LPS + IFN-γ活化的RAW264.7细胞，采用CLSM和流式细胞术检测细胞对游离DiD和DiD- nps的摄取;CLSM结果显示，与游离DiD相比，DiD-NPs的细胞摄取显著提高(图2a, b)。流式细胞术分析显示，在LPS + IFN-γ激活的RAW264.7细胞中，DiD-NPs的荧光强度约为游离DiD的4.98倍，在RAW264.7细胞中为1.33倍(图2c）。LPS + IFN-γ活化的RAW264.7细胞表面CD44和叶酸受体表达显著增加(图2d)。当用游离HA或FA预处理LPS + IFN-γ激活的RAW264.7细胞以竞争过表达的CD44或叶酸受体时，DiD-NPs的摄取分别降低至未处理细胞的51.8%和65.1%;当同时加入HA和FA时，信号水平下降到24.5%(图2e)。共聚焦显微镜显示DiD-NPs与CD44受体和叶酸受体共定位，表明DiD-NPs可以靶向促炎巨噬细胞表面的双重受体(图2f)。
图2 RBA-NPs在体外表现出靶向性
3.RBA-NPs在体内表现出靶向性
然后，通过大鼠尾根部皮下注射CFA建立大鼠佐剂性关节炎(AIA)模型，研究NPs在大鼠体内的分布。造模后大鼠经尾静脉注射游离DiD或DiD- nps。采用免疫荧光法对关节进行切片和染色。同样，CD44受体和叶酸受体在炎症关节的炎症巨噬细胞(如CD68标记的)上过度表达(图3a)。与体外数据一致，DiD- nps处理组的滑膜关节DiD荧光高于游离DiD组(图3b, c)。此外，DiD- nps组的DiD信号主要与CD44受体和叶酸受体重叠，而游离DiD组的CD44受体和叶酸受体共定位水平较低。因此，使用活体成像系统测量给药后0.5、2、6、12、24和48 h关节内DiD的荧光强度(图3d)。游离DiD处理的AIA大鼠炎症关节中几乎没有荧光信号，而NPs组早在0.5 h就可以观察到强烈的荧光信号。DiD-NPs组在各时间点均表现出较高的荧光强度，荧光持续至48 h。在给药后6、12和24小时，我们还评估了DiD-NPs在AIA大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾和关节中的分布(图3e)。很明显，炎症关节的荧光强度强于心脏、肺和肾脏。脾脏的高荧光水平可能与脾脏是重要的免疫器官有关。这些结果表明，制备的双靶向纳米颗粒可以有效地选择性地将载药物质递送到促炎巨噬细胞，并显著增强AIA大鼠炎症关节内的蓄积。
图3 RBA-NPs在体内表现出靶向性
4. RBA-NPs抑制AIA大鼠炎症并促进骨侵蚀修复
接下来，在AIA大鼠中评估RBA-NPs治疗的治疗效果(图4a)。本部分选择糖皮质激素药物地塞米松(dexamethasone, Dex)作为阳性药物对照组。Dex具有强大的抗炎和镇痛作用，是目前缓解RA患者症状的常用药物。Dex组给药方案与RBA-NPs组相同。关节炎诱导14 d后，AIA大鼠足踝、足爪肿胀严重。大鼠静脉注射生理盐水或RBA- nps (5 mg/kg RBA)。如图4b, f, g所示，RBA-NPs和Dex表现出较强的治疗效果，给药后明显缓解疾病发展，减轻足部肿胀。相比之下，空白NPs组AIA大鼠的足跖厚度和关节炎评分与AIA组几乎没有差异，而游离RBA只能轻度降低AIA大鼠的足跖肿胀和关节炎评分。为了进一步评估关节炎症和软骨破坏水平，我们对大鼠踝关节切片进行了组织学分析。AIA组和空白NPs组he染色可见大量炎性细胞浸润，滑膜重度增生。与AIA组相比，游离RBA组在缓解这些症状方面效果有限，而RBA- nps和Dex强烈减轻了滑膜炎症(图4c)。Safranin-O Fast-Green染色显示，AIA组和空白NPs组部分关节切片大部分软骨和骨组织消失。与之形成鲜明对比的是，RBA-NPs组和Dex组关节软骨完整且染红，表明RBA-NPs有效减轻了关节软骨损伤(图4d)。免疫上，AIA组的脾脏和胸腺指数显著高于正常大鼠，而RBA-NPs和Dex处理组的脾脏和胸腺指数显著降低，几乎达到对照水平(图4h, i)。免疫组化检测显示，RBA-NPs有效地下调炎症细胞因子的分泌，如IL-1β(图4e)， IL-6和TNF-α在踝关节。
为了检查RBA-NPs是否可以恢复骨功能和促进组织修复，使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色的破骨细胞和碱性磷酸酶(ALP)免疫组织化学染色的成骨细胞来评估RBA-NPs对关节炎关节中相关标志物表达水平的影响(图4j)。TRAP染色显示骨髓腔内的破骨细胞呈红色，TRAP阳性的含有3个以上核的多核细胞为破骨细胞。结果显示AIA组大鼠踝关节出现大量破骨细胞和骨侵蚀，而RBA-NPs和Dex减少破骨细胞数量，促进骨损伤修复，ALP表达显著增加(用箭头标记成骨细胞产生的地方)。进一步的实验表明，RBA-NPs和Dex降低了大鼠关节炎关节中核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达水平，上调了骨保护素(OPG)水平，导致RANKL/OPG比值降低(图4k)。
然后使用micro-CT分析以更可视化的方式进一步验证骨侵蚀(图4l)。顶部和底部图像分别代表同一只大鼠的前外侧和后外侧踝关节。箭头用于标记骨组织损伤发生的部位。在治疗后28 d, AIA组和空白NPs组出现了粗糙的骨表面和严重的骨侵蚀。与正常大鼠相比，两组大鼠的骨密度(BMD)显著降低，关节软骨评分和BS/BV显著增加。尽管免费RBA只对骨侵蚀提供了适度的缓解，RBA- nps和Dex治疗导致了光滑的骨表面和接近正常大鼠的高骨密度(图4 - 0)。意料中的是，RBA-NPs和Dex治疗在减少骨小梁分离(Tb.Sp)和增加骨小梁厚度(Tb.Th)方面表现出最显著的效果(图4p, q)。所有这些数据都支持RBA-NPs可以有效地抑制AIA大鼠软骨损伤的进展和促进骨侵蚀修复。
图4 RBA-NPs抑制AIA大鼠炎症并促进骨侵蚀修复
5. RBA-NPs将促炎M1巨噬细胞重编程为抗炎M2巨噬细胞
为了验证这种可能性，使用小鼠和人巨噬细胞系RAW264.7和THP-1细胞。用LPS + IFN-γ或IL-4 + IL-13预处理这些细胞诱导M1或M2表型极化。然后对这些细胞进行CD68和F4/80(泛巨噬细胞标志物)、CD86 (M1标志物)和CD206 (M2标志物)的免疫荧光染色分析。与预期一致，LPS和IFN-γ预处理的RAW264.7细胞中CD86的表达显著增加。RBA-NPs处理后，CD86的荧光强度降低，而CD206的荧光强度升高，提示巨噬细胞可能由M1型再极化为M2型(图5a)。另一方面，RBA-NPs对M2型巨噬细胞无明显影响。THP-1细胞也有类似结果(图5a)。这些数据表明，RBA-NPs有效地促进了小鼠和人巨噬细胞的m1到m2的复极化。
此外，利用RAW264.7和THP-1细胞进行的流式细胞术也验证了这一假设(图5b)。RBA-NPs处理后，RAW264.7细胞中M1型和M2型巨噬细胞比例分别由38.9%和0.076%下降至29.7%和18.4%。在THP-1细胞中，该比例分别从53.5%和0.32%变化到25.8%和30.9%。最后，RBA-NPs显著抑制两种细胞系中M1标记物(包括iNOS, TNF-α， IL-1β)的表达水平，并提高M2标记物(包括Arg-1, IL-10和TGF-β)的表达水平(图5c)。综上所述，RBA-NPs导致巨噬细胞M1向M2表型转化。
图5 RBA-NPs在RAW264.7和THP-1细胞中将促炎M1型巨噬细胞重编程为抗炎M2型巨噬细胞
6.RBA-NPs通过下调糖酵解活性水平来驱动m1向m2表型转换
然后，利用蛋白质组学方法探索了RBA-NPs重编程巨噬细胞的机制。在分析的巨噬细胞中共鉴定出4,068种蛋白。与对照组相比，RBA-NPs处理显著改变了235个蛋白质的表达水平，其中106个上调，129个下调(图6a)。对这些显著影响的蛋白质进行了GO和KEGG富集分析。GO分析结果表明，这些蛋白主要参与代谢过程、免疫系统过程、固有免疫和适应性免疫反应、炎症反应和催化活性。免疫和炎症蛋白的参与不足为奇，但代谢相关蛋白的大量鉴定出乎意料。因此，通过KEGG富集进一步分析这些蛋白的相关代谢组学通路(图6b)。可见，受RBA-NPs处理影响的蛋白质富集于脂肪酸代谢、糖酵解等通路。因此，RBA-NPs治疗似乎在蛋白质翻译水平上调节了能量代谢和免疫系统。如前所述，RA的免疫微环境促进了巨噬细胞从FAO到糖酵解的代谢重编程。PPI网络再次显示，节点中最集中的蛋白是参与三个重要代谢过程的蛋白:糖酵解、FAO和OXPHOS，其中糖酵解通常被认为是主要的代谢模式。
因此，检测了M1型巨噬细胞的糖酵解能力，以检查RBA-NPs对细胞内能量代谢的调节。细胞外酸化速率(ECAR)是糖酵解活性的指标44结果表明，M1巨噬细胞中的ECAR比正常细胞高2.5倍(图6c)。经20或40 μM RBA-NPs处理后，M1型巨噬细胞ECAR接近正常。如图6d所示，RBA-NPs处理可以提高M1型巨噬细胞的低ATP生产，剂量越大，效果越强。RBA-NPs还以剂量依赖性方式减少乳酸生成，乳酸生成是糖酵解期间的重要产物(图6e)。同时，RBA-NPs抑制了M1巨噬细胞中乳酸脱氢酶A (LDHA)的高水平(图6i)， LDHA在催化糖酵解的最后一步中起关键作用46此外，RBA-NPs抑制M1型巨噬细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(图6f-h)。RBA-NPs可下调M1型巨噬细胞糖酵解水平，且剂量越大，作用越强。
在接下来的实验中，进一步研究了ERK和GLUT1。与静态巨噬细胞相比，M1型巨噬细胞中ERK、HIF-1α和GLUT1蛋白含量确实增加(图6j)。20 μM RBA-NPs可抑制这些蛋白的水平，40 μM RBA-NPs的抑制作用更强，表明RBA-NPs对ERK、HIF-1α和GLUT1的抑制作用呈浓度依赖性。然后，使用ERK siRNA敲低ERK(图6j)。在此条件下，RBA-NPs不影响HIF-1α和GLUT1的表达，这与目前ERK位于HIF-1α和GLUT1上游的信号传导模型一致。
进一步的流式细胞术分析也表明，敲低ERK后，RBA-NPs对M1/M2比例基本没有影响，因为敲低ERK后，M2巨噬细胞的比例显著增加，其本身高达68.8%(图6k)。相反，在没有siERK处理的情况下，RBA-NPs再次降低了cd68阳性巨噬细胞的比例，并增加了cd206阳性巨噬细胞的数量。此外，M1型标志物iNOS、TNF-α、IL-1β和M2型标志物Arg-1、IL-10、TGF-β的表达检测也得到了一致的结果(图6i)。
因此，这些证据都支持RBA-NPs可能通过阻断ERK/HIF-1α/GLUT1通路重编程巨噬细胞极化。
图6 RBA-NPs通过阻断ERK/HIF-1α/GLUT1通路下调糖酵解水平，从而驱动m1向m2表型转换
结论
综上所述，构建了一种具有ph敏感性和CD44/叶酸受体靶向能力的自组装纳米胶束来递送RBA。所设计的具有疏水核心的胶束有效地包裹了RBA。RBA-NPs在关节炎关节中的聚集显著增强，并与M1型巨噬细胞有较强的重叠。因此，RBA-NPs通过将M1型巨噬细胞重编程为M2型巨噬细胞来抑制炎症细胞因子的表达并促进组织修复，从而提供了强大的抗ra治疗效果。我们还发现RBA-NPs通过阻断ERK/HIF-1α/GLUT1通路诱导m1到m2表型转换。因此，在本研究中，基于RBA构建了一种有效的抗ra纳米治疗剂，并揭示了其作用机制，为通过调控代谢通路来逆转细胞类型提供了实例。
Jia N, Gao Y, Li M, Liang Y, Li Y, Lin Y, Huang S, Lin Q, Sun X, He Q, Yao Y, Zhang B, Zhang Z, Zhang L. Metabolic reprogramming of proinflammatory macrophages by target delivered roburic acid effectively ameliorates rheumatoid arthritis symptoms. Signal Transduct Target Ther. 2023 Jul 28;8(1):280. doi: 10.1038/s41392-023-01499-0.
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