金合欢素是一种天然黄酮类化合物，具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗氧化、保护心血管、调节脂质代谢、预防骨质疏松。鉴于金合欢素具有优异的抗炎活性，其通过调节炎症来缓解 RA 的潜力及其具体作用机制仍不确定，值得进一步研究。
2024年10月21日，南开大学药学院白钢/侯媛媛/张曼团队在 Phytomedicine 上发表了题为“Acacetin alleviates rheumatoid arthritis by targeting HSP90 ATPase domain to promote COX-2 degradation”的文章，研究证明Acacetin通过特异性结合HSP90的ATP酶域，促进HSP90与COX-2的解离，诱导巨噬细胞中COX-2的泛素化降解。这一过程抑制了促炎细胞因子的产生及炎症相关信号通路的激活，表现出显著的抗炎效果。因此，Acacetin作为一种新型的HSP90 ATP酶抑制剂，为RA的治疗提供了新的策略。
摘要
建立胶原诱导的RA小鼠模型来评价金合欢素的治疗效果。合成金合欢素功能探针以捕获 RAW264.7 细胞中的潜在靶蛋白。进行了各种小分子-蛋白质相互作用方法来验证金合欢素与靶蛋白的结合。进行分子对接和定点诱变测试来分析特异性结合位点。通过免疫共沉淀、免疫荧光测定和蛋白质印迹研究金合欢素通过靶向 HSP90 对 COX-2 降解的影响。Acacetin 特异性结合 HSP90 的 ATP 结构域，促进 HSP90 和 COX-2 之间的解离，诱导巨噬细胞中 COX-2 的泛素降解。金合欢素抑制促炎细胞因子的产生以及炎症相关通路，在 RA 中发挥优异的抗炎作用。该研究证明金合欢素是一种新型HSP90 ATP酶抑制剂，可抑制客户蛋白COX-2的功能折叠，促进其泛素降解，从而达到抗炎作用。靶向 HSP90 是一种抑制炎症的可行策略，为控制与 RA 相关的关节炎症和疼痛提供了一种独特的方法。
1.金合欢素在体内减轻 CII 诱导的 RA 小鼠
最初建立RA小鼠模型是为了评价金合欢素的功效；实验方案如图1A所示。用金合欢素治疗的RA小鼠的发病率显著降低（图1B）。金合欢素治疗改善了RA小鼠后爪的肿胀形态，并且观察到后爪肿胀程度和总体爪关节炎指数(AI)呈浓度依赖性降低(图1C、D )。此外，给小鼠注射金合欢素可显著增强小鼠对压力刺激的疼痛耐受力（图 1E）。金合欢素还显著抑制血清中总 IgG 的生长，这是 RA 自身抗体的标志性特征之一（图 1F）。金合欢素有效逆转 RA 小鼠后爪温度（图 1G），并降低小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的水平（图 1H - J）。
图1.给予金合欢素可缓解类风湿性关节炎小鼠的肿胀、疼痛、局部温度升高和炎症
接受不同治疗后的爪子正中矢状切面的 Micro-CT 3D 重建和成像表明，金合欢素可以减轻 RA 小鼠后爪的骨侵蚀，并增加后爪的骨矿物质密度（BMD）（图 2A）。爪关节病理结果显示，对照组踝关节软骨表面光滑，关节腔明显。而模型组爪关节软骨受损、变薄，部分骨组织发生融合。金合欢素治疗有效减少了关节周围组织的炎症浸润和软骨损伤，炎症、骨侵蚀和软骨损伤的组织学评分降低也证明了这一点（图2B））。滑膜组织的病理结果显示，与模型组相比，金合欢素治疗减弱了踝关节滑膜组织增殖和血管翳形成，同时减少了纤维化面积和肥大细胞计数（图2C）。
图2.金合欢素治疗可减轻 RA 小鼠的骨侵蚀和滑膜增生
2.金合欢素的靶蛋白捕获和相互作用验证
为了探索金合欢素可能靶向的蛋白质，合成了炔基金合欢素，以获得金合欢素修饰的功能化MM，用于目标捕获和跟踪（图3A）。图 3B考马斯亮蓝染色左图显示金合欢素修饰的功能化磁性微球（泳道 3）内的蛋白质显著富集，而对照组（泳道 2）则相反。基于蛋白质质谱分析，HSP90 被推测为金合欢素最有可能的蛋白质，因为与 RA 相关的其他蛋白质相比，HSP90 具有优异的匹配性和覆盖度。为了进一步证实这一预测，进行了蛋白质印迹来评估富集的蛋白质。如图3B右图所示，与泳道2相比，泳道3中的HSP90蛋白条带显著富集，表明HSP90是金合欢素的靶标之一。
为了验证金合欢素和HSP90之间的相互作用，根据我们之前的研究，通过炔基金合欢素与叠氮香豆素反应来研究HSP90和金合欢素之间的共定位分析。将 HSP90 抗体与 Alexa Fluor 647 荧光二抗孵育，观察到 HSP90 在细胞质中的分布呈红色荧光（图 3C）。合并图像显示，炔基金合欢素与 HSP90 蛋白在细胞中共定位（以黄色表示）（Pearson 相关系数为 0.92），证实了 HSP90 可能是金合欢素目标的预测。还进行了细胞热位移测定 (CETSA)，以验证金合欢素在细胞环境中与 HSP90 的有利相互作用。如图 S6 所示，CETSA 证明金合欢素增强了 RAW264.7 细胞中 HSP90 的热稳定性。为了探讨金合欢素与HSP90相互作用的可行性，通过SPR和荧光猝灭法检测金合欢素与HSP90的结合亲和力分别为12.2μM和26.1μM（图3D，E）。利用 FTS 评估金合欢素对 HSP90 蛋白稳定性的影响。如图3F所示，金合欢素诱导HSP90的熔解曲线向右移动，并导致热变性温度升高2.28℃，从而为金合欢素和HSP90蛋白之间的相互作用提供了进一步的证据。
图3 . HSP90 蛋白被确定为金合欢素的靶标
3.金合欢素与HSP90结合位点的研究
为了探索 HSP90 和金合欢素之间的潜在结合方式，进行了分子对接。从对接结果(图4A )可以观察到ATP与HSP90的NTD结构域中的Asn-51、Ser-52、Asp-93、Gly-97、Lys-112和Phe-138形成氢键。蛋白质，结合能为 –4.76 kcal/mol。金合欢素与 HSP90 蛋白中的 Asn-51、Asp-93、Asn-106 和 Phe-138 结合，结合能更好，为 –6.18 kcal/mol。因此，金合欢素和 ATP 可能会竞争相同的结合位点（Asn-51、Asp-93、Phe-138）。这些关键氨基酸位点在人类、大鼠、小鼠和马中表现出高度保守性（图4B）。进行 FRET 以确定金合欢素是否对 HSP90 的 ATP 结合袋有影响。图4C显示了HSP90蛋白/金合欢素-香豆素的强荧光信号，在475 nm处检测到。然而，在用格尔德霉素（Gel）预孵育的竞争组中，在相同发射波长处受体荧光强度减弱。另外，金合欢素-香豆素组和凝胶组中几乎没有检测到荧光。这一结果表明金合欢素可能与 HSP90 ATP 酶抑制剂 Gel 类似地靶向 HSP90 ATP 结构域。为了验证预测氨基酸位点的可靠性，在大肠杆菌中表达并纯化了重组WT人HSP90和人HSP90甘氨酸置换突变蛋白N51G、D93G和F138G系统。采用荧光猝灭法测定各种突变蛋白的KD值。图4D显示D93G和F138G突变体的K D值显著高于野生型和N51G突变体，证明金合欢素可以结合HSP90的Asn-93和Phe-138位点。
图4 .金合欢素 (Ac) 靶向 HSP90 蛋白的 ATP 结构域
4.Acacetin 通过抑制 HSP90 ATPase 诱导 COX-2 的泛素依赖性降解并下调炎症相关信号通路
我们前期的研究初步证明COX-2是HSP90的客户蛋白之一。Co-IP 实验旨在研究金合欢素对 COX-2 和 HSP90 蛋白的影响。如图5A所示，HSP90蛋白有效地捕获来自RAW264.7细胞的COX-2蛋白。与金合欢素一起孵育后，这两种蛋白质之间的相互作用减弱。COX-2是泛素-蛋白酶体系统的底物。免疫荧光分析显示 Mod（LPS 加 IFN-γ）组中 COX-2 表达显著增加，部分与 HSP90 共定位（图 5B）。同时，用金合欢素处理细胞导致 COX-2 蛋白水平显著降低。COX-2 与 HSP90 融合显著降低，Pearson's R 值从 0.81 降至 0.29，而泛素蛋白酶体抑制剂 MG-132 可逆转这一现象。炎症介质的下调减弱了 RA 中炎症相关信号通路（PI3K-AKT 和 NF-κB 信号通路）的异常激活。如图5C所示Mod组中的p-AKT、p-NF-κB水平相对于对照细胞显著增强。与 Gel 类似，金合欢素降低 AKT 和 NF-κB 磷酸化，而不影响 HSP90 蛋白表达。上述结果表明，金合欢素通过抑制 HSP90 ATPase 诱导 COX-2 的泛素依赖性降解，并在体外下调下游炎症反应过程。
图5金合欢素靶向 HSP90 ATPase 结构域，然后促进客户蛋白 COX-2 的泛素依赖性降解，从而发挥抗炎活性
5.靶向 HSP90 下调 RA 巨噬细胞中 COX-2 的表达
靶向巨噬细胞中的 COX-2 蛋白已成为缓解 RA 的关键策略。为了评估金合欢素通过巨噬细胞调节对 RA 发病机制的影响，进行了免疫组织化学实验来评估小鼠爪切片中 CD68 的表达（图 6A，B）。结果表明，对照组内 CD68 阳性区域的比例升高，而金合欢素治疗后该比例显著下降 ( p < 0.01)。进行免疫荧光实验以共定位和定量分析 HSP90、COX-2 和 CD68。图6C结果表明，注射胶原蛋白的小鼠表现出较高的 CD68 和 COX-2 表达水平，但金合欢素干预可逆转这种表达水平。
图6. Acacetin 靶向 RA 小鼠爪子巨噬细胞中的 HSP90，促进 COX-2 降解，从而发挥抗炎作用
为了进一步验证金合欢素在体内的抗RA机制，通过免疫荧光评估了PI3K-AKT和NF-κB信号通路相关的RA炎症。数据表明 RA 小鼠爪子中 p-AKT/AKT 和下游 p-NF-κB/NF-κB 显著上调 ( p < 0.05)。然而，施用金合欢素有效地逆转了这些参数。金合欢素治疗降低了p-AKT、p-NF-κB和AKT的蛋白水平（图7A、B），证实金合欢素可以抑制体内炎症过程。
图7 . Acacetin 影响体内 PI3K-AKT 和 NF-κB 信号通路
结论
总之，金合欢素通过与其 ATP 结构域结合来抑制 HSP90，导致 HSP90 释放 COX-2，随后促进泛素介导的 COX-2 降解。这些发现为 RA 提供了一种新的治疗策略。HSP90 ATPase 可能成为缓解 RA 的潜在靶点。
Wang W, Zhai S, Yang W, Gao H, Chang N, Zhang M, Hou Y, Bai G. Acacetin alleviates rheumatoid arthritis by targeting HSP90 ATPase domain to promote COX-2 degradation. Phytomedicine. 2024 Oct 21;135:156171. doi: 10.1016/j.phymed.2024.156171.
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