为了研究NAP-3在代谢性疾病辅助治疗中的作用，我们评估了8周内各组的代谢表型。与正常饮食（ND）组相比，喂食高脂饮食（HFD）的小鼠体重明显增加（图1A）。单独补充二甲双胍（HFD+Met）的组显示出与单独补充NAP-3（HFD+NAP-3）相当的体重趋势。尽管NAP-3本身对体重没有影响，但与单独服用二甲双胍的组相比，服用HFD并同时服用二甲双胍和NAP-3的小鼠体重有所下降（图1A，B）。与其他组相比，二甲双胍和NAP-3组（HFD+Met+NAP-3）的组合显示出更少的脂肪量和肝脏重量（图1C），这与体重调查结果一致。然而，表型数据与食物摄入量的变化无关，因为所有喂食HFD的组都表现出相当的食物摄入量，无论是否添加任何额外的补充剂（图1D）。上述结果表明，在联合处理组中观察到的体重减轻不是能量消耗减少的结果。尽管二甲双胍和NAP-3联合组的饮水量略有下降，但喂食HFD的两组之间的饮水量没有显著差异（图S2）。单用二甲双胍组、单用NAP-3组和联合处理组的快速血糖均有不同程度的下降；特别是，与其他组相比，联合处理组倾向于向ND组正常化（图1E）。在联合处理组中，与单独使用二甲双胍相比，血清胰岛素、口服葡萄糖耐量（OGTT）、胰岛素耐量（ITT）和胰岛素抵抗（HOMA-IR）指数显著降低，但OGTT期间胰岛素分泌显著增加（图1F，L）。研究还表明，与单独使用二甲双胍相比，联合处理组的血清脂质水平（总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)）显著降低（图1M，N）。此外，如图2J所示，eWAT中的脂肪细胞大小也支持了这一确认。二甲双胍和NAP-3处理小鼠对代谢表型的有益作用被放大，这表明二甲双胍和NAP-3联合处理具有协同作用。

图1 与单独使用二甲双胍相比，NAP-3联合二甲双胍治疗可改善葡萄糖代谢和脂质代谢。（A）8周的体重（n=10）。（B）不同处理8周后的体重（n=10）。（C）主要器官的器官指数。不同处理8周后OGTT期间的总能量摄入（D）、空腹血糖（E）、空腹胰岛素水平（F）和胰岛素分泌（G）。不同处理8周后，口服葡萄糖耐量试验（OGTT）（H）、OGTT曲线下面积（AUC-OGTT）、胰岛素耐量试验。结果以平均值±SEM表示，*p<0.05和**p<0.01。

为了研究二甲双胍和NAP-3协同作用的机制，我们评估了肝功能、氧化应激和组织病理学。联合处理组的血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）水平降低（图2A、B和S3），表明与单独使用二甲双胍相比，二甲双胍和NAP-3联合处理在一定程度上改善了肝功能损害。抗氧化系统和自由基之间的不平衡导致氧化应激，这是胰岛素抵抗的关键因素，通过复杂的机制降低外周胰岛素敏感性并导致T2D的发展。如图2E所示，与正常饮食组相比，喂食HFD的小鼠的氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）水平降低，而丙二醛（MDA）水平升高，表明HFD小鼠存在一定的氧化损伤。单独使用二甲双胍或单独使用NAP-3处理时，负面影响在不同程度上减弱。二甲双胍和NAP-3的联合给药可以通过提高GSH、CAT和SOD水平以及降低MDA水平来显著改善抗氧化性能和氧化应激损伤。通过H&E染色分析肝脏组织病理学，我们评估了联合处理对肝脏形态的影响，暴露于HFD的小鼠出现脂肪肝，组织空泡化增加。单独服用二甲双胍的小鼠肝组织形态略有改善，而单独服用NAP-3的小鼠则没有显著改善。与单独使用二甲双胍组相比，联合组的肝细胞结构更正常，细胞形态更完整，空泡更少（图2I）。上述结果表明，二甲双胍联合NAP-3可能更有效地改善HFD诱导的氧化应激和肝损伤。

由于多糖的不易消化和不可吸收特性，我们假设NAP-3可能参与肠道功能。DAO和d-LA用于评估肠道屏障功能，因为它们提供了有关肠道内壁完整性和潜在生态失调的补充信息。与单独使用二甲双胍组相比，联合用药组的DAO和d-LA血清水平分别降低了34.62%和48.28%（图2C，d）。H&E染色的结肠组织结果显示，HFD小鼠的结肠黏膜层厚度显著减少，绒毛缺失。联合组的肠黏膜损伤得到改善，因此更接近正常结肠组织（图2K）。

膳食纤维可能通过影响肠道微生物成分来影响肠道屏障功能。我们进行16S rRNA测序，分析联合处理对肠道微生物结构的影响，进一步探讨二甲双胍和NAP-3对肠道屏障的影响。维恩图显示，五个组共享1097个OTU（图3A）。使用UniFrac的主坐标分析（PCoA）表明，不同处理组的微生物群组成存在差异（图3B）。HFD和NAP-3干预都导致了微生物群落结构的显著变化。与单独使用二甲双胍组相比，HFD+NAP-3组和HFD+NAC-3+Met组的微生物更独立，这表明联合用药组的变化更多是由于添加了NAP-3。Shannon和Simpson指数分析的α多样性表明，NAP-3和二甲双胍联合处理组的群落异质性高于其他组（图3C）。门水平的DNA测序显示，放线菌门和疣微菌门的水平增加，而厚壁菌门和变形菌门在联合组中下降（图3D，E）。在属水平上，结果表明，联合处理可能导致拟杆菌属、阿克曼菌属、Odoribacter、瘤胃球菌和双歧杆菌属的丰度上升，而乳杆菌属的丰度下降（图3F，H）。在Met+NAP-3组中观察到的变化归因于NAP-3对属分布的影响。特定属细菌丰度因NAP-3处理后发生变化，因为Met+NAP-3组反映了单独使用NAP-3组的情况，而非单独使用二甲双胍组的情况。某些类型的细菌丰度因NAP-3的存在而变化，因为MET+NAP-3组的属丰度与NAP-3组相似，但与二甲双胍组不同。换句话说，当与二甲双胍联合使用时，NAP-3对属分布的影响增强。线性判别分析（LDA）显示双歧杆菌科，uncultured_Bacteroidales_bacterium在HFD组中富集，然后乳杆菌被认为是组合组中的关键物种（图3I）。总的来说，上述发现强调了糖尿病模型小鼠和服用二甲双胍、NAP-3或两者组合的小鼠之间肠道微生物群特征和组成的差异，这表明二甲双胍和NAP-3对不同属的丰度具有协同作用。根据KEGG途径分析，与初级胆汁酸生物合成和脂肪酸代谢相关的代谢途径得到了富集（图3J）。代谢关键指标与肠道微生物之间的Spearman相关性分析表明，Odoribacter与CAT、SOD呈负相关，与MDA呈正相关；双歧杆菌与DAO呈正相关；放线菌与TC、γ-GT呈正相关。阿克曼菌、Verrucomicrobiales、Verrucommicrobiae和乳杆菌与GLP-1、GSH、TC和TG呈正相关，而与DAO呈负相关。瘤胃球菌与FBG、MDA呈正相关，与GSH呈负相关。

图3 NAP-3与二甲双胍协同作用，重塑肠道微生物群。肠道微生物群的维恩图分析（A）。β多样性：肠道微生物群的PCoA显示不同的治疗组（B）。alpha多样性：Shannon和Simpson（C）。门水平上主要细菌的相对丰度水平（D）。每个组中特定细菌门的相对丰度（E）。主要细菌属的相对丰度水平（F）。每个实验组中特定细菌属的相对丰度（G）。通过Kruskal-Wallis比较确定的重要属的数量（H）。利用LDA进行评估（I）。使用KEGG注释分析五类关键修饰代谢途径（J）。代谢关键指标与肠道微生物（K）之间相关系数的热图。结果以平均值±SEM表示，*p<0.05和**p<0.01。

与肠道微生物的结果一致，这些减少的微生物属在产生BSH酶方面有着共同的作用，BSH酶可以解偶联牛磺酸或甘氨酸偶联的BA，从而产生非结合的BA。如图4A所示，与单独使用二甲双胍组相比，Met+NAP-3组的BSH活性显著减弱。初级BA转化为次级BA取决于BSH对BA的解偶联。为了阐明BSH活性下调是否影响BA谱，我们利用UPLC/qTOF-MS靶向代谢组学方法定量粪便中的BA。结果表明，NAP-3的干预改变了粪便胆汁酸谱（图4B，C）。尽管两组之间的总胆汁酸没有显著变化，但喂食NAP-3和二甲双胍的小鼠中结合胆汁酸的百分比明显高于单独服用二甲双胍的组（图4B）。与其他组相比，联合处理组牛磺结合BA的粪便水平，尤其是TUDCA和TβMCA，显著升高（图4C）。BA组成的变化以及结合BA的增加进一步证实，NAP-3干预通过重塑肠道微生物群和降低肠道BSH酶活性来影响胆汁酸代谢。

图4 与NAP-3的协同处理诱导回肠中结合胆汁酸的积累。不同处理组（A）粪便中的BSH活性。回肠中未结合、结合和总胆汁酸水平（B）。不同处理组回肠胆汁酸概况（C）。结果以平均值±SEM表示，*p<0.05和**p<0.01。

小鼠产生的主要BA是CA和βMCA，它们分别通过替代途径和经典途径产生。BA的合成涉及几种酶，包括Cyp7a1、Cyp27a1、Cypr8b1和Cyp7b1（图5A），据报道，这些酶受到肠道微生物群的影响。主要代谢为胆汁酸的胆固醇水平在联合处理组中有所降低（图1M），而Cyp27a1和Cyp7b1的mRNA表达水平在替代途径中升高（图5B），表明促进了βMCA的产生。此外，蛋白质印迹证实，联合处理诱导了替代途径中BA合成酶的蛋白质表达水平升高（图5C）。

基于这些结果，我们推测TβMCA升高可能导致Cyp7b1介导的胆汁酸合成增加和微生物解偶联减少。

胆汁酸是通过其激素受体、核FXR和膜G蛋白偶联受体5（TGR5）协同调节宿主代谢的信号分子。当给予联合处理时，我们发现TβMCA作为FXR的拮抗剂在回肠中显著增加；同样，TUDCA作为TGR5的激动剂也显示出显著增加的水平（图4C）。与单独使用二甲双胍和单独使用NAP-3组相比，联合处理组的FXR显著降低，TGR5增强（图6A，C），表明肠道FXR抑制以及TGR5激活是肠道微生物来源胆汁酸信号传导的潜在靶点。鉴于L细胞中FXR缺乏和TGR5激活都会刺激GLP-1分泌，我们接下来测定了血清GLP-1含量。结果显示，与其他组相比，给予联合处理时，OGTT期间GLP-1释放增加，胰岛素分泌增加（图6B）。这些结果为以下假设提供了证据，即NAP-3和二甲双胍组合对葡萄糖代谢的积极影响是由肠道微生物胆汁酸FXR/TGR5依赖的GLP-1信号介导的。

图6 结合胆汁酸调节核受体FXR/TGR5以促进GLP-1的释放。回肠中关键核受体基因的相对表达（A）。血清中活性GLP-1水平（B）。回肠关键核受体蛋白的相对表达（C）。结果以平均值±SEM表示，*p<0.05和**p<0.01。

T2D是一种长期代谢性疾病，由心血管疾病、视网膜病变、神经病变和死亡率等各种问题引起。肠道微生物群被认为是一个“代谢器官”，对宿主代谢过程的调节起着重要作用。此外，患者肠道微生物群的复杂性会影响临床结果。因此，现代药理学非常重视了解肠道微生物如何影响宿主代谢，并开发新的治疗方法。目前T2D临床联合处理的潜在问题促使人们寻找安全有效的植物来源替代品。在我们之前的研究中，已经确定NAP-3可以与二甲双胍联合使用，在T2D小鼠中发挥更好的血糖和体重控制作用。在这里，我们证明了多糖NAP-3与二甲双胍协同作用，重塑肠道微生物，进一步减少BSH酶的产生，促进胆汁酸合成，导致结合胆汁酸积累。累积的结合胆汁酸TβMCA和TUDCA分别与FXR和TGR5受体结合，上调GLP-1分泌并增强葡萄糖稳态。总体而言，观察到的NAP-3与二甲双胍协同作用的显著改善作用表明，NAP-3是一种新型的潜在肠道微生物依赖性多糖，可用于辅助治疗T2D。

结果表明，单独服用NAP-3并不能显著改善体重、血糖异常和代谢表型，而与二甲双胍联合使用则显示出代谢效率。事实上，二甲双胍是代谢效应的主要驱动因素，因为单独服用二甲双胍足以控制血糖和血清生化指标。当NAP-3与二甲双胍联合使用时，这种有益作用显著增强，这意味着NAP-3的存在增强了二甲双胍的代谢益处。因此，在这种联合处理模式中存在涉及复杂机制的潜在协同作用，NAP-3创造了一个积极的微生物环境，使二甲双胍能够充分代谢。除了涉及AMPK依赖性介导机制外，近年来发现二甲双胍通过肠道微生物抑制肠道FXR信号传导来改善代谢功能障碍，这表明调节肠道微生物和代谢物是治疗T2D的一种潜在医学治疗策略。肠道微生物介导的多糖对代谢可塑性的积极作用已被广泛报道。我们的研究结果表明，NAP-3，无论是单独使用还是与二甲双胍联合使用，都是高度可发酵的，并且对双歧杆菌、瘤胃球菌和阿克曼菌等肠道微生物的结构变化负责。一项针对小鼠的研究表明，二甲双胍提高了阿克曼菌的丰度，这是一种与肠道健康和改善血糖控制相关的肠道微生物。这一观察结果在其他临床实验中也得到了证实，在这些实验中，接受二甲双胍的患者除了几种产生SCFA的肠道细菌外，还增加了阿克曼菌，包括双歧杆菌、瘤胃球菌等。这些结果与我们在属水平上发现的肠道微生物组成的一些变化是一致的。总的来说，与单独使用二甲双胍相比，NAP-3通过产生有益细菌为二甲双胍代谢创造了更有利的积极环境。

生物转化中的酶促反应涉及由BSH促进的解偶联的初始步骤，该步骤触发甘氨酸或牛磺酸从偶联的BAs C24 N-酰基酰胺键水解。先前的研究表明，BSH活性的降低导致胆汁酸比率改变，FXR-FGF15信号传导受到抑制，从而减轻高胆固醇血症。施用氨苄青霉素通过抑制肠杆菌介导的BA脱偶联来减少回肠FXR信号传导，导致TCA和TβMCA的初级偶联物水平升高。已经发现几种类型的细菌会产生BSH，如乳杆菌和双歧杆菌等，而在我们的实验中，乳杆菌占总数的40%以上，与单独使用二甲双胍相比，联合用药组的乳杆菌呈下降趋势。一致地，联合组的肠道BSH酶活性、血清胆固醇水平和肝脏胆固醇水平显著下调，这表明二甲双胍与NAP-3联合使用抑制了肠道BSH酶类活性，抑制了胆汁酸解偶联，并影响了肝脏和血清胆固醇水平。FXR和膜G蛋白偶联受体（TGR5）已被证明是调节胆汁酸稳态、调节胆固醇代谢和维持葡萄糖稳态的胆汁酸反应性转录因子。在这里，我们发现，在联合处理组中，BSH酶活性的降低导致牛磺偶联BA的相对含量增加，包括TβMCA（小鼠FXR最丰富的拮抗剂）和TUDCA。在之前的报告中，牛磺结合的β-和α-鼠胆酸（TβMCA和TαMCA）被确定为FXR的天然拮抗剂，并且发现肠道微生物群通过减弱回肠中的FXR抑制来调节BA合成的产生。最近进行的研究表明，TUDCA拮抗FXR，逆转CDCA对FXR信号的激活。TGR5是另一种参与宿主代谢的胆汁酸反应受体，被认为是一个有趣的靶点，在胆汁酸稳态中起着重要作用。我们观察到，联合组TβMCA和TUDCA的积累导致FXR活性的抑制和TGR5的激活。主流观点认为，FXR与回肠远端的胆汁酸结合，影响Fgf15（人类Fgf19）的转录。FGF15/19分泌到门静脉并转移到肝脏，在那里它与FGFR4/β-klotho异二聚体复合物结合，并启动信号级联，导致Cyp7a1的转录调控。然而，在最近的研究中，Cyp7a1^-/-小鼠对HFD表现出改善的胰岛素敏感性和葡萄糖耐量，主要是由于Cyp7b1上调导致TβMCA含量增加。我们的研究进一步证实了这一发现，其中联合处理组的Cyp27a1和Cyp7b1表达上调，而Cyp7a1和Cypr8b1与单独使用二甲双胍相比保持相似。因此，肠道FXR的抑制导致肝胆汁酸合成基因转录水平升高，从而促进初级胆汁酸生物合成并增加胆固醇消耗。我们推测，共轭BA TβMCA的积累是BA合成替代途径上调和BA解偶联抑制共同作用的结果。

有趣的是，抑制肠道FXR和激活TGR5可以促进GLP-1的分泌和产生，这表明在我们的实验中，联合组在OGTT期间GLP-1的显著释放可能是由于FXR抑制和TGR5激活的协同刺激。

总之，NAP-3和二甲双胍协同低血糖的机制涉及以下方面：（1）NAP-3为二甲双胍提供了有益的肠道代谢环境，诱导BSH产生菌群的相对丰度降低，阿克曼菌的相对丰度增加，这有利于二甲双胍的代谢。（2）BSH酶活性的降低导致胆汁酸池中结合胆汁酸的相对丰度增加，特别是TUDCA和TβMCA。（3）BA合成替代途径（而不是经典途径）的上调有助于TβMCA的进一步积累。（4）累积的结合BA拮抗FXR并激活TGR5以促进GLP-1的释放，从而诱导胰岛素分泌以降低血糖。总而言之，NAP-3通过肠道微生物胆汁酸核受体-GLP-1串扰轴放大了二甲双胍对T2D小鼠葡萄糖代谢的积极影响。结果表明，多糖NAP-3可能是辅助治疗T2D的候选天然产物。