复方小类1区：广州中医大&东莞市中医院揭示补阳还五汤调节cAMP/PKA/CREB通路改善缺血性脑卒中突触可塑性

亮点：

1. 通过蛋白质组学，cAMP/PKA/CREB通路可能改善突触可塑性；

2. 补阳还五汤可以改善MCAO大鼠神经元的突触可塑性；

3. 补阳还五汤含药血清可改善（OGD/R）SH-SY5Y损伤。

该实验共检测到6270种蛋白质。与假手术组相比，模型组显示837个DEPs，其中324个上调，513个下调（图1A）。与模型组相比，补阳还五汤组显示435个DEP，252个蛋白质上调，183个蛋白质下调。（图1B）。通过层次聚类分析，对不同组之间的DEP进行分析，以探索蛋白质的变化模式（图1C-D）。与模型组相比，补阳还五汤组中与突触可塑性途径相关的几种关键蛋白显著上调，如Shank2（基因：Shank2）、突触结合蛋白1（基因：Syt1）、Dlg4（基因：Psd95）和Prkacb（基因：Prkacb）。这表明，在MCAO大鼠中，用补阳还五汤处理后，受损脑组织中与神经元突触可塑性相关的因子的表达水平增加。这表明与这些关键蛋白质相关的突触信号通路可能被激活。分析采用Wooking HPLC系统进行，条件和程序如表1和表2所示。而表3和表4提供了详细的液相和质谱条件（Q-Exactive）。

图1 蛋白质组学分析。（A–B）火山图；（C-D）层次聚类热图；（E）补阳还五汤组和模型组之间与突触可塑性相关的关键蛋白的变化；（F-G）模型组与假手术组、补阳还五汤组与模型组PPI网络图。蓝色表示下调，红色表示上调。

表1 HPLC条件

表2 梯度洗脱程序

表3 液相条件

表4 Q-exacting质谱仪条件

PPI分析结果显示，模型组中Vamp2、Syn1和Syt1等蛋白质的表达显著下调。相比之下，补阳还五汤组中Dlg4、Syngap1和Camk2a等蛋白质的表达显著上调。这些差异蛋白，包括Dlg4、Syngap1、Camk2a、Shank2、Shank3、Syt1、Vamp2、Syn1和Syt1，都与神经突触可塑性的信号通路密切相关。这表明补阳还五汤可能通过改善神经突触可塑性来发挥其治疗缺血性卒中的作用（图1F-G）。

GO富集结果如图2A-B所示。与假手术组相比，生物学过程表明，模型组的DEPs主要参与突触中的囊泡介导的运输、突触囊泡循环和突触组织。细胞成分涉及突触后膜、谷氨酸突触、突触后致密区等。分子功能涉及肌动蛋白结合、钙调素结合、蛋白激酶结合等。经补阳还五汤治疗后，MCAO大鼠脑组织中差异蛋白的功能涉及生物过程，包括化学突触传递的调节、突触可塑性的调节和突触信号传递。细胞成分涉及谷氨酸突触、突触后致密区、树突棘等。分子功能主要包括突触后致密区的结构成分、突触结构成分、PDZ结构域结合等。

图2 生物信息学分析。（A-B）GO富集分析显示模型组与假手术组和补阳还五汤组与模型组的差异表达；（C-D）KEGG富集分析显示模型组与假手术组和补阳还五汤组与模型组的差异表达。

KEGG的前20条富集途径如图2C-D所示。模型组和假手术组之间差异蛋白的富集分析共富集了54条相关通路，涉及252种差异蛋白。富集程度较高的途径包括突触小泡循环、内吞作用、谷氨酸能突触等。在补阳还五汤组和模型组之间，有26条富集的KEGG通路，包括91种差异蛋白，谷氨酸能突触、cAMP信号通路和cGMP-PKG信号通路等通路的富集程度较高。

KEGG富集结果表明，与缺血性卒中调控密切相关的信号通路与突触功能有关，如谷氨酸能突触、钙信号通路、cAMP信号通路等。其中，cAMP信号通路对细胞代谢和行为过程至关重要，在缺血性卒中发生后受到抑制（图3）。Atp2b2在维持脑神经元Ca²⁺稳态方面至关重要。中风后，Atp2b2的下调导致钙流出不足，Camk2a与钙信号通路密切相关。经补阳还五汤治疗后，Atp2b2、Camk2a、Prkacb和Gria3等表达增加，表明BYHWD可能通过cAMP信号通路治疗缺血性卒中。

cAMP信号通路在中枢神经系统内的突触可塑性中起着关键作用。PKA-CREB是NMDAR和Psd95表达和激活的关键上游调节因子，p-CREB调节BDNF以保护神经元功能，改善突触可塑性，并确保突触后NMDAR和AMPAR的正常运作。当中风发生时，cAMP表达的减少会导致PKA、CREB和BDNF通路中重要蛋白质的合成减少，从而导致海马神经元的损伤，这可能进一步导致突触损失和LTP的异常诱导。此外，谷氨酸（Glu）是中枢神经系统中一种重要的兴奋性神经递质，由于缺血性卒中后氧气供应不平衡和能量代谢紊乱，其在突触前过度释放，与突触后NMDAR结合。这不仅会导致大量Glu的耗竭，还会在兴奋后引发NMDAR的失活，最终导致突触功能障碍。本研究的结果表明，补阳还五汤可能通过多种靶点和信号通路对突触重塑产生影响，包括谷氨酸能突触、钙信号通路、多巴胺能突触和cAMP信号通路。cAMP信号通路参与上述突触通路的调节，反映了其在建模前后以及药物干预前后的重要作用。因此，本研究计划在以后的体内和体外实验中进一步验证蛋白质组学筛选结果，重点研究补阳还五汤基于cAMP/PKA/CREB信号通路改善缺血性卒中后突触可塑性的机制。

模型建立后，模型组和补阳还五汤治疗组的大鼠体重均显著降低（P<0.01，图4A）。给药后第三天，与模型组相比，其他组的体重出现了统计学上的显著增加。（P<0.05）。与模型组第一天相比，第七天的体重也略有增加，没有统计学差异。实验结果表明，补阳还五汤能有效提高MCAO大鼠的体重，促进身体恢复。

图4 补阳还五汤增强MCAO大鼠的神经功能。（A）补阳还五汤对MCAO大鼠体重变化的影响（n=13）。（B–C）TTC染色和MCAO后梗死体积分析（n=3）。（D）HE染色（n=3，比例尺=100μm）。受损的神经细胞由红色箭头突出显示。*P<0.05，**P<0.01。

TTC染色用于评估脑损伤的严重程度（图4B-C）。正常大鼠脑组织被染成红色，而缺血再灌注的梗死区被染成白色。模型组脑梗死体积明显增加（P<0.05）。经补阳还五汤（10 g/kg和20 g/kg）处理后，脑梗死体积显著减少。结果表明，补阳还五汤可显著减少MCAO大鼠的脑梗死体积。

我们使用HE染色评估组织形态变化（图4D）。各组脑组织结果表明，假手术组皮质和海马神经元形态正常，胞质丰富，核清晰，排列有序。与其他组相比，模型组缺血皮质和海马表现出不同程度的坏死，具体表现为脑基质疏松、水肿和血管周围空间增加，尤其是在皮质和海马的CA1区，组织损伤更为严重。此外，缺血皮层和海马体中大量神经元丢失，大部分剩余神经元表现出细胞质萎缩和核萎缩。一些神经元随意聚集在一起，破裂并肿胀。补阳还五汤治疗后，缺血皮质和海马中一些神经元的病理状态有所改善。细胞空间变窄，固缩细胞数量减少。补阳还五汤（10 g/kg和20 g/kg）干预后，皮质和海马的神经元结构显著增强。细胞边界和细胞核更清晰，完整细胞和健康细胞的数量大幅增加。脑组织损伤减轻，进一步表明补阳还五汤能有效减轻缺血再灌注引起的脑损伤。

透射电子显微镜用于观察皮质（图5A）和海马（图5D）突触的超微结构。在假手术组中，皮质区的神经元细胞核呈椭圆形轮廓，形态规则，核膜完整。我们观察到更多的突触，它们显示出不同的轮廓和完整的结构，与海马区相似。相比之下，MCAO大鼠的大脑表现出严重的神经元损伤，包括细胞体肿胀和聚集、细胞膜收缩和变形以及核膜不完整。突触数量显著减少，许多突触结构溶解，突触轮廓变得模糊。给药后，受损的突触显示出显著的改善，神经元细胞损伤减少，线粒体数量增加。细胞核和小泡清晰可见，突触结构相对完整，突触数量显著增加。突触后致密区的厚度显著增加，而突触接触的曲率明显增加（图5B-C）。各组大鼠海马区突触的超微结构与皮质区相似。补阳还五汤显著改善了海马区突触的损伤，突触后致密区的厚度和突触界面的曲率显著增加（图5E-F）。

图5 补阳还五汤改善了大鼠皮质和海马区突触的超微结构（n=3）。（A）皮质区突触的超微结构（比例尺=2μm）。（B）皮质区突触后致密区的厚度。（C）皮质区突触界面的曲率。（D）海马区突触的超微结构（比例尺=2μm）。（E）海马区突触后致密区的厚度。（F）海马区突触界面的曲率。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。

Golgi染色法用于评估细胞体、树突和树突棘的形态变化（图6A-D）。从结果可以看出，20-60μm交点处的分布最高，然后逐渐减小。从分布图中还可以看出，高剂量组的趋势与假手术组非常相似。与其他组相比，模型组在每个距离的交叉值最低，表明补阳还五汤可以改善树突的形态（图6E-F）。Golgi-Cox染色显示，脑缺血再灌注后，顶端和基底树突之间的交叉点总数显著减少（图6G-H）。补阳还五汤（10 g/kg和20 g/kg）干预后，顶端和基底树突交叉的数量显著增加（P<0.05）。此外，我们测量了V层神经元顶端和基底树突分支的总长度（图6I-J）。在模型组中，脑缺血再灌注后，顶端和基底树突分支的总长度显著缩短。然而，补阳还五汤治疗组顶端和基底树突分支的总长度显著增加（P<0.05）。

同时，我们对每组前额叶皮层的第五层锥体神经元进行了研究。在假手术组中，前额叶Ⅴ层锥体神经元的顶部和底部有许多树突棘（图6K）。模型组树突棘少，密度显著降低（P<0.01）。与模型组相比，补阳还五汤低、中剂量组前额叶皮层Ⅴ层锥体神经元的顶端树突棘密度增加，基底树突棘密度没有显著变化。然而，大剂量补阳还五汤给药后，大鼠额叶皮层锥体神经元顶部和底部的树突棘密度显著增加（P<0.01）。此外，神经元顶端和基底部分的成熟和未成熟树突棘密度显著增加（图6L-P）。

图6 补阳还五汤能有效增加顶端和基底树突分支的长度总和。（A）用Golgi-Cox染色法处理的代表性冠状切片（比例尺=500μm）。（B）V层锥体神经元示例（比例尺=20μm）。（C）描绘顶端树突和基底树突之间边界的示意图。（D）用Sholl分析处理的神经元示意图。（E）相对于胞体，从近端到远端分布的顶端树突交叉点。（F）从与胞体相关的近端区域延伸到远端区域，基底树突交叉点的分布。（G）每组顶端树突交叉的总数。（H）各组内基底树突交叉的累积计数。（I）每组顶端树突分支长度的总和。（J）每组基底树突分支的累积长度。（K）每组V层锥体神经元顶端和基底树突棘的形态变化（比例尺=5μm）。（L）总顶端树突棘和未成熟顶端树突棘密度的比较。（M）成熟顶端树突棘密度的比较。（N）基底树突棘总密度的比较。（O）成熟基底树突棘密度的比较。（P）未成熟基底树突棘密度的比较（n=9）。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。

TUNEL法用于检测神经元凋亡（图7）。TUNEL阳性信号显示为红色。假手术组TUNEL阳性细胞数量减少，只有少数细胞凋亡。模型组TUNEL阳性细胞显著增加（P<0.05），但补阳还五汤治疗组TUNEL阳性神经元明显减少（P<0.05），尤其是10g/kg和20g/kg的BYHWD。

图7 补阳还五汤可减少大鼠缺血再灌注后脑神经元的凋亡（n=3）。（A）TUNEL染色结果（比例尺=100μm）。（B）TUNEL阳性细胞的定量百分比。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。

研究结果显示，正常对照组（10%FBS）和空白血清对照组的OD值相当，表明空白血清的作用与10%FBS相当，促进SH-SY5Y细胞的生长（图8A）。由于25%空白血清的OD值与10%空白血清相比略有降低，因此选择10%空白血清的浓度进行后续实验。与OGD/R模型组的空白血清相比，血清浓度为5%、10%和25%的补阳还五汤可以显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率，其中10%的效果最好。为了保证测试结果的可信度，后续实验中使用的含药物血清的最终浓度选择为10%。

使用显微镜检查细胞形态，并使用CCK-8试剂盒评估细胞存活率（图8B-C）。模型组细胞存活率和细胞密度显著降低（P<0.01）。H89组可降低细胞存活率（P<0.05）。经5%补阳还五汤血清组和10%补阳还五汤血清+H89组处理后，细胞形态和细胞存活率略有改善（P>0.05）。含10%补阳还五汤血清组、福司柯林组和含10%补阴还五汤+福司柯林组合显著提高了细胞存活率，改善了细胞形态，并逐渐从皱纹变为纺锤形。细胞密度也显著增加。

在凋亡试剂盒中，绿色荧光表示细胞处于枯萎的早期阶段，而红色荧光表示细胞在枯萎或坏死的晚期阶段。模型组中具有红色和绿色荧光的细胞数量显著增加，表明总凋亡率增加。与模型组相比，含5%BYHWD血清的总凋亡率变化不大，而含10%BYHWD的血清的总细胞凋亡率显著降低，表明凋亡率随着含药物血清剂量的增加而降低，具有一定的浓度依赖性。H89组也增加了细胞凋亡率。此外，含10%补阳还五汤+H89组、福司柯林组和含10%补阳还五汤+福司柯林处理组均能显著降低刺激后的细胞凋亡率。结果表明，含补阳还五汤的血清对（OGD/R）SH-SY5Y细胞具有一定的抗凋亡作用（图8D）。

图8 含补阳还五汤血清对SH-SY5Y细胞存活率的影响。（A）不同浓度的空白血清和药物血清对OGD/R细胞的影响（n=6，#P<0.05，##P<0.01，与对照组相比有显著性差异。与OGD/R模型（10%FBS）组相比，◇P<0.05，◇◇P<0.01具有显著性差异。与5%空白血清OGD/R组相比，△P<0.05、△△P<0.01具有显著性差异。与10%空白血清OGD/R组相比，*P<0.05、**P<0.01具有显著性差异。与25%空白血清OGD/R组相比，○P<0.05、○○P<0.01）。（B）不同组别的细胞存活率（n=6，#P<0.05，##P<0.01与对照组相比有显著性差异。*P<0.05、**P<0.01与模型组相比有显著性差异）。（C）药物处理后不同组细胞的形态学图像（n=6，比例尺=100μm）。（D）含补阳还五汤血清对SH-SY5Y细胞凋亡的影响（n=3）。白色箭头突出了凋亡的晚期。

模型组和H89组的红色荧光显著降低，表明Syt1、Psd95和Syn1蛋白的表达显著降低（P<0.05）。在其他组中，含补阳还五汤的血清或福司柯林处理后，Syt1、Psd95和Syn1的荧光强度增加（P<0.05）。Syt1、Psd95和Syn1的荧光强度显著增强，表明补阳还五汤含药血清可以改善OGD/R细胞中突触相关蛋白Syt1、Psd95和Syn1的表达（图9）。

图9 含补阳还五汤血清对SH-SY5Y细胞蛋白质含量的影响（n=3）。（A）荧光显微镜图像（比例尺=50μm）。（B）每组的Psd95、Syn1和Syt1的荧光强度值。与对照组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。

MCAO/R大鼠皮质（图10A-B）和海马（图11A-B）中Bcl-2、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1和BDNF的相对mRNA表达显著降低。补阳还五汤处理后，各给药组皮质和海马中的mRNA表达均有所增加。OGD/R模型组的结果也非常相似（图12A-B），Bcl-2、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF和Creb1 mRNA的相对表达水平显著降低，而Bax mRNA的相对表示水平升高。给药后，各给药组Psd95、Shank2、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2和Creb1的mRNA表达增加，而Bax mRNA的相对表达降低。H89组Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2和Creb1 mRNA的表达受到一定程度的抑制。在给予含10%补阳还五汤的血清组、福司柯林组、含10%补阴还五汤血清+福司柯林的组后，各给药组中Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2、Bcl-2/Bax和Creb1的mRNA表达均显著升高。用于RT-qPCR的引物序列如表5所示。

图10 补阳还五汤对皮质区脑损伤的影响被逆转。（A–B）使用RT-qPCR分析大鼠皮质区Prkacb、Syt1、BDNF、Creb1、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Psd95、Shank2和Syn1的mRNA表达（n=3）。（C–E）代表性免疫印迹图像和cAMP、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Bcl-2、Syt1、BDNF、p-Creb1、Creb1和Bax的定量（n=3）。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。

图11 补阳还五汤对海马区脑损伤的影响被逆转。（A-B）采用RT-qPCR分析法测定大鼠海马中Prkacb、Syt1、BDNF、Creb1、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Psd95、Shank2和Syn1的mRNA水平（n=3）。（C–E）代表性免疫印迹图像和cAMP、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、Bcl-2、BDNF、p-Creb1、Creb1和Bax的定量（n=3）。与假手术组相比，#P<0.05和##P<0.01具有显著性差异。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01有显著性差异。

表5 用于RT-qPCR的引物序列

MCAO/R大鼠皮质和海马中cAMP、Psd95、Shank2、Bcl-2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF和p-Creb1的表达水平显著降低（p<0.05），而Bax的表达水平则显著升高（图10C-E、图11C-E）。与模型组相比，补阳还五汤给药大鼠皮质和海马中的蛋白质表达呈相反趋势（P<0.05），特别是在高剂量补阳还五汤组（P<0.01）。在OGD/R细胞模型中观察到类似的效果，模型组cAMP、Bcl-2、Psd95、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF和p-Creb1的表达水平降低，而Bax的表达水平升高（P<0.05，见图12C-E）。含5%BYHWD血清组和含10%BYHWD+H89血清组给药后，cAMP、Psd95、Syt1、Bcl-2、Prkacb、BDNF、p-Creb1和Bcl-2/Bax的表达增加。H89组给药后对Prkacb有一定的抑制作用。含10%补阳还五汤血清组、福司柯林组、含10%补阳还五汤+福司柯林处理组给药后，各组cAMP、Psd95、Bcl-2、Shank2、Syn1、Prkacb、Syt1、BDNF、Bcl-2/Bax和p-Creb1的相对表达水平呈上升趋势（p<0.05）。

与模型组相比，中、高剂量补阳还五汤组在连续给药7天后显著降低了MCAO大鼠的神经功能评分和梗死体积，同时增加了MCAO鼠的体重。结果表明，补阳还五汤改善了中风后的神经功能缺损，促进了身体的恢复。结果与之前的研究一致。中风后脑氧供应不足可能会引发一系列不可避免的事件，如兴奋毒性、细胞凋亡和炎症反应。HE结果表明，补阳还五汤中剂量组和高剂量组在组织病理变化方面表现出更明显的改善，炎症减少。此外，TUNEL检测结果表明，补阳还五汤可以缓解脑缺血再灌注损伤期间的细胞凋亡，其中高剂量组的效果最为显著。细胞实验结果还表明，含补阳还五汤的血清有效地改善了OGD/R细胞的形态，降低了其凋亡率。

突触作为神经元之间的连接点，在信息处理、传输和存储中起着至关重要的作用。中枢神经元的树突和树突棘是突触信号传递的重要部位。中风后，血流减少或中断会使树突和树突棘成为最脆弱的结构单位。血流减少90%会导致树突棘迅速丧失和不可逆的树突损伤。对这些单位的持续损伤会破坏兴奋性突触活动模式，导致梗死周围和远端区域的神经元回路损伤，损害突触发生的功能。树突长度代表整个突触空间。树突棘密度反映了兴奋性突触的密度。增加突触形成的策略包括树突树枝化和增加树突棘密度，以促进大脑中神经元回路的重组。树突棘是突触形成的重要组成部分。树突棘的动态变化是突触可塑性的结构基础。该动物实验验证了补阳还五汤使用Glogi染色显著增加了MCAO大鼠大脑中顶端和基底树突分支长度和树突棘密度。此外，体外实验表明，含补阳还五汤的血清有效地提高了突触相关蛋白的表达水平。

不同类型的树突棘具有不同的功能和作用。树突棘的形成或增大表明突触连接增强，而树突棘的收缩或消失表明突触连接减弱。成熟的树突棘（蘑菇形，短粗）在神经突触的发育、成熟、稳定性和突触连接中起着至关重要的作用，而未成熟的树突棘（薄，丝状）有助于增加将发育中的轴突与靶树突连接的可能性。本研究结果表明，与模型组相比，补阳还五汤中、高剂量组显著增加了V层锥体神经元顶端和基端成熟和未成熟树突棘的密度，表明补阳还五汤促进突触发生和发育，增加树突复杂性，改善突触可塑性，从而减轻缺血再灌注引起的神经元损伤。

cAMP信号通路与神经元突触可塑性密切相关。cAMP和PKA共同调节细胞生长、分化、代谢、凋亡等生物过程。在PKA和cAMP结合后，PKAc被释放，然后进入细胞核，导致CREB磷酸化。这一过程调节下游靶基因的转录和效应蛋白的合成，从而产生一系列生理效应。CREB在涉及神经发育、再生和修复的突触可塑性过程中起着至关重要的作用。PKA-CREB通路的激活已被证明可以增加NMDAR的表达，增强突触LTP，对学习和记忆能力产生积极影响。沉默CREB基因会进一步恶化模型动物的认知功能。磷酸化CREB通过促进新突触的形成，并通过调节BDNF、c-fos和c-jun等下游凋亡基因参与神经元的存活和修复过程，展现出神经保护特性。BDNF是CREB转录调控的靶点，在与其受体TRκB结合时触发RAF-MEK-ERK信号通路，导致ERK1/2激活，进而促进新突触的形成，从而改善突触可塑性。Psd95是主要在成熟兴奋性谷氨酸能突触中发现的最丰富和最重要的支架蛋白。它对突触后膜的受体活性和稳定性至关重要，在突触可塑性中起着重要作用，并介导突触后膜突触功能的变化，使其成为突触信息传递和整合的最关键突触蛋白。

通过动物和细胞实验，结果表明，补阳还五汤及其含药血清激活了cAMP/PKA/CREB信号通路，增加了MCAO大鼠脑组织或OGD/R细胞中cAMP、PKA、p-Creb1蛋白的表达水平，随后调节了BDNF、Syt1、Syn1和Psd95等下游蛋白的表达，改善了细胞突触可塑性，减轻了细胞凋亡。

由于缺血性卒中的发病机制多种多样，实验性物理诱导的动物模型往往缺乏稳定性。在未来的实验中，如果体内实验可以与转基因动物模型相结合进行药物验证，那么更深入地探索药物的靶点和疾病机制将是更好的选择。所有药物研究最终都服务于临床，强调临床和实验工作的结合。在未来与补阳还五汤相关的研究中，应加强临床沟通与合作，从临床患者身上收集足够的血液或排泄物等生物样本，用于代谢组学或综合组学研究。通过生物信息学分析和体内/体外试验，我们可以深入验证和讨论补阳还五汤抗缺血性卒中的机制。