旋覆花（Inula japonica Thunb），又名旋复花，为菊科旋覆花属多年生草本植物，是我国一种常用中药，《本草纲目》早有记载“旋复花性味咸，归肝胃肺经，具有利湿消痰、行气散结之功”，现代药理学研究表明旋覆花具有显著的抗肿瘤活性，然而其有效成分、作用机制及靶标并不明确。
2022年3月10日，中国科学院基础医学与肿瘤研究所覃江江研究员和程向东教授、上海中医药大学交叉科学研究院张卫东教授合作在Molecular Cancer上发表题为“Targeting E2 ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5c by small molecule inhibitor suppresses pancreatic cancer growth and metastasis”研究文章，发现中药旋覆花中的一种半萜内酯化合物DHPO（旋复花内酯/大花旋覆花素）能够作为UbcH5c抑制剂显著抑制胰腺癌的生长与转移。
摘要
利用公开数据集的转录组数据分析IAPs与E2的相关性，以及E2 UbcH5c在胰腺癌中的生物学功能。采用基于结构的虚拟筛选方法鉴定UbcH5c抑制剂，并采用表面等离子体共振分析和细胞热位移实验评估其结合亲和力。通过体内外实验验证了其抗癌活性，并通过转录组学和蛋白质组学分析探索了相关机制，并通过western blot、免疫荧光和qRT-PCR进行了验证。UbcH5c与iap在胰腺癌中的表达呈正相关。进一步发现UbcH5c在胰腺癌中高表达并与不良预后相关。我们发现了一种小分子UbcH5c抑制剂，称为DHPO，可直接与UbcH5c蛋白结合。DHPO抑制胰腺癌细胞活力和克隆形成，诱导细胞凋亡，抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭。该化合物可抑制ubch5c介导的IκBα降解和NF-κB活化，这对其抗癌活性至关重要。此外，DHPO抑制了两种原位胰腺肿瘤小鼠模型的肿瘤生长和转移。这些结果表明，抑制UbcH5c是一种新的有效的治疗胰腺癌的策略，DHPO代表了一类新的UbcH5c抑制剂，有可能成为进一步开发的抗胰腺癌治疗药物。
1.UbcH5c高表达与IAP表达及胰腺癌患者不良预后相关
为了确定哪些E2与IAPs协同泛素化，首先比较了胰腺肿瘤组织和正常组织之间21个E2的mRNA表达水平，并发现从UCSX xena获得的TCGA TARGET GTEx数据集中，与正常组织相比，所有这些E2的mRNA表达水平在肿瘤样本中均上调。鉴于2s在胰腺癌患者中过表达，进行了IAP家族和2s mRNA表达水平的相关性分析，并确定了6个2s作为候选药物靶点。如图1a所示，UBE2A、UBE2B、UBE2D1、UBE2D3（也称为UbcH5c）、UBE2E1、UBE2E3的mRNA表达水平与cIAP1有更强的正相关，UBE2A与XIAP （r > 0.7）的相关性更强。在6个2s中，只有UbcH5c对胰腺癌患者的总生存时间有负面影响（图1b）。此外，使用在线工具CVCDAP [28]， UbcH5c在肿瘤组织中的mRNA表达相对于来自TCGA TARGET GTEx数据集的正常组织的水平显著上调（图1c），并在来自TCGA数据集的配对的邻近非肿瘤组织中显著上调（图1d）。此外，在Human protein Atlas中，胰腺肿瘤组织中的UbcH5c蛋白水平高于正常组织（图1e）。为了进一步研究UbcH5c在胰腺癌发生中的作用，利用生物信息学方法分析了TCGA数据库中胰腺癌患者的基因表达谱。相关散点图显示，UbcH5c的表达与细胞增殖相关基因ki-67、PCNA、抗凋亡相关基因Bcl2、Bcl-xl以及emt相关基因Vimentin、N-Cadherin的表达呈正相关（图1f）。值得注意的是，最近的研究表明，UbcH5c参与了数十种蛋白的泛素化，并调节了与细胞增殖、抗凋亡和转移相关的各种通路。
图1 UbcH5c（又名UBE2D3）在胰腺癌中高表达，且与胰腺癌患者的不良预后相关
2.一种新的小分子UbcH5c抑制剂的鉴定
为了鉴定UbcH5c的小分子抑制剂，以UbcH5c为底物，对内部天然产物文库进行了分子docking和基于结构的虚拟筛选试验，发现了一种名为2α,6α-diacetoxy-4β-hydroxy-11(13)-pseudoguaien-12,8α-olide (DHPO)的活性化合物（图2d）。分子docking结果表明，DHPO通过与Leu86和Arg90的氨基形成氢键来靶向UbcH5c（图2a，b, c）。为了进一步验证DHPO与UbcH5c的直接相互作用，通过表面等离子体共振实验评估了它们的结合亲和力。如图2e和f所示，我们观察到DHPO与UbcH5c蛋白的相互作用，平衡解离常数（KD）为3.75 × 10-5 m。在Panc1和SW1990细胞中，细胞热位移实验进一步证实了DHPO-UbcH5c的结合。western blot结果显示，在对照组中，UbcH5c在较低的温度下表达，随着温度的升高，UbcH5c表达消失。然而，加入DHPO后，在50℃时出现了一条较强的UbcH5c条带，即使温度升高到58℃，仍可检测到蛋白条带（图2g），这表明在Panc1和SW1990细胞中，DHPO均有效地与UbcH5c蛋白结合。
图2 DHPO直接靶向UbcH5c
3. DHPO在体外对胰腺癌细胞具有抗癌活性
为了检测DHPO对胰腺癌细胞活力的抑制作用，用不同浓度的DHPO处理CFPAC1、HPAC、BxPC3、Panc1、SW1990、Capan2、AsPC1等7种胰腺癌细胞株和正常胰腺细胞株HPNE 72 h。如图3a所示，DHPO呈浓度依赖性地显著抑制胰腺癌细胞株的生长。其对胰腺癌细胞株的细胞毒性（IC50 = 2.5 ~ 8.5 μM）明显高于正常胰腺细胞株HPNE （IC50 = 25 μM）。集落形成实验显示，DHPO显著降低了集落形成效率（图3b和c）。为了确定DHPO对细胞凋亡的影响，采用流式细胞术进行Annexin V-FITC双染实验。结果表明，DHPO以浓度依赖性的方式诱导胰腺癌细胞凋亡（图3d和e）。进一步进行划痕愈合实验和transwell侵袭实验，分别评估DHPO对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响。如图3f和h所示，DHPO显著抑制了Panc1和SW1990细胞的迁移。同样，DHPO浓度依赖性地抑制了Panc1和SW1990细胞的侵袭（图3g和图i）。
图3 DHPO抑制胰腺癌细胞增殖、诱导凋亡、抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭
4.转录组分析显示TNF-α/NF-κB通路参与了DHPO的抗癌活性
为了研究DHPO抑制胰腺癌细胞增殖和迁移的分子机制，以二甲基亚砜（DMSO）处理作为对照，对DHPO处理后的Panc1细胞进行了RNA测序。事实上，主成分分析（PCA）表明，与对照相比，DHPO的主成分1 （PC1）和PC2发生了变化（图4a）。经初筛，共有527个基因被鉴定为差异表达基因。其中，DHPO组中有323个基因上调，204个基因下调（图4b）。为了深入了解下调基因对生物学过程影响的全局模式，我们进行了GO和KEGG分析。总之，结果显示DHPO处理后下调的基因主要涉及细胞周期、细胞分裂、细胞增殖、DNA修复、DNA复制等生物学过程或信号通路（图4c、d），进一步证实DHPO抑制Panc1细胞增殖，诱导细胞凋亡。为了更全面地了解DHPO与对照组相比所改变的通路，我们对下调基因进行了基因集富集分析（GSEA）。对于Hallmark基因集，富集结果表明，通过NF-κB的TNF-α信号通路在对照组中富集（图4e）。DHPO可能通过抑制TNF-α/NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用。转录组数据生成了TNF-α信号通路中通过NF-κB基因集的基因热图（图4f）。推测DHPO与UbcH5c的直接相互作用降低了IκBα的泛素化和降解，抑制了NF-κB的活化及其下游靶基因的表达。
图4 Panc1细胞的转录组鉴定出下调的通路
5.蛋白质组学分析进一步证实了DHPO的抗癌活性
为了进一步阐明DHPO抗癌的潜在机制，对DHPO处理和未处理的Panc1细胞进行了多重串联质谱标签（TMT）定量蛋白质组学研究。在所有样本中共鉴定和注释了5505条独特的多肽。PCA显示DHPO组的PC1和PC2与对照组相比发生了变化（图5a）。如图5b所示，检测dhpo处理组和未处理组Panc1细胞的差异表达蛋白。与对照组相比，DHPO处理后163个蛋白的表达水平发生了显著改变。其中15个蛋白表达下调，148个蛋白表达上调。为了全面了解差异表达蛋白的功能，使用Metascape]进行通路和蛋白相互作用富集和聚类分析。通路富集分析揭示了与凋亡信号通路调节、蛋白定位到细胞核、MYC活性通路、抗原呈递和RNA代谢相关的通路（图5c），表明DHPO对细胞增殖和细胞死亡的总体影响。接下来，我们使用分子复合物检测算法识别涉及通路的蛋白质-蛋白质相互作用簇，包括代谢和细胞对DNA损伤刺激的反应（图5d）。
图5 Panc1细胞的蛋白质组学显示富集的通路
6. DHPO可抑制TNF-α诱导的NF-κB通路活化
然后评估DHPO对TNF-α诱导的NF-κB通路活化的影响。如图6a所示，在TNF-α处理的Panc1和SW1990细胞中，DHPO浓度依赖性地抑制IκBα的磷酸化，稳定IκBα，并降低总NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65的水平。我们还发现，在TNF-α刺激后，DHPO显著降低了NF-κB p65的核转位（图6b）。为了深入了解在DHPO处理的Panc1和SW1990细胞中，NF-κ b驱动的转录活性降低的后果，进行了蛋白质印迹分析，并表明DHPO处理显著下调下游基因c-Myc（细胞周期的驱动因素）和Mcl-1（抗凋亡）的表达（图6c）。实时荧光定量pcr检测DHPO或DMSO处理后Panc1和SW1990细胞中TNF-α/NF-κB信号通路相关基因的表达。与对照组相比，DHPO处理引起所有检测的TNF-α/NF-κB信号通路相关基因的显著抑制（图6d和e）。
图6 DHPO通过抑制NF-κB通路抑制胰腺癌细胞生长和转移
7. UbcH5c在DHPO的抗癌活性中发挥重要作用
为了进一步研究DHPO与UbcH5c的结合是否具有抗癌活性，我们构建了慢病毒短发卡RNA （lenti-shRNA）载体来敲低（KD） UbcH5c在Panc1和SW1990细胞中的表达。与对照shRNA相比，UbcH5c shRNA显著沉默了UbcH5c的表达（图7a和b）。western blotting实验显示，UbcH5c KD特异性地阻断了DHPO诱导的IκBα去磷酸化和稳定，从而逆转了DHPO对Panc1和SW1990细胞中NF-κB p65磷酸化和活化的抑制作用（图7a和b）控制单元（图7c和d）。
图7 敲低UbcH5c可降低DHPO的抗癌活性
8.DHPO在体内可抑制原位胰腺肿瘤的生长和转移，且不引起明显的宿主毒性
为了研究DHPO在体内的抗癌效果，建立了胰腺癌Panc1和SW1990原位肿瘤模型，分别给予对照组和DHPO腹腔注射35 d和28 d，然后通过活体成像系统直接监测生物发光信号。结果显示，对照组肿瘤生长迅速，而接受DHPO治疗的组明显抑制了肿瘤生长（图8a和b）。如图8c和e所示，与对照组小鼠相比，在Panc1和SW1990原位肿瘤模型中，DHPO分别抑制了80.67%和78.74%的肿瘤生长。为了监测DHPO潜在的体内副作用，每3天测量体重。在平均体重方面没有显著差异（图8d和f），这表明DHPO在有效剂量下没有引起任何明显的宿主毒性。
图8 DHPO抑制体内原位胰腺肿瘤生长
我们进一步评估了DHPO在体内对胰腺肿瘤转移的影响。如图9a和图9b所示，DHPO治疗显著防止了Panc1和SW1990肿瘤转移至肝脏、腹膜和脾脏。与对照处理的小鼠相比，DHPO将携带原位Panc1肿瘤的小鼠的腹膜和肝转移发生率分别从7/9和6/9降至4/9和3/9（图9c），将携带原位SW1990肿瘤的小鼠的腹膜、肝和脾转移发生率分别从13/15、9/15和9/15降至8/16、6/16和4/16（图9d）。从小鼠身上获取重要器官，包括肝、肺、肾、脾、心和脑，进行组织学检查。DHPO处理组未发现这些器官的组织学变化，而对照组有肝和脾转移（图9e），这证实了DHPO在有效剂量下没有显著的宿主毒性。
图9 DHPO可抑制胰腺癌的体内转移
结论
在本研究中，证明了UbcH5c与胰腺癌的临床相关性，并鉴定了一种有效的UbcH5c抑制剂DHPO，该抑制剂通过抑制NF-κB信号通路在体外和体内胰腺癌细胞模型中显示出抗癌效果。综上所述，我们的研究结果为胰腺癌的治疗提供了一个新的和有前景的靶点，并为人类癌症的治疗提供了候选药物。
Qi S, Guan X, Zhang J, Yu D, Yu X, Li Q, Yin W, Cheng XD, Zhang W, Qin JJ. Targeting E2 ubiquitin-conjugating enzyme UbcH5c by small molecule inhibitor suppresses pancreatic cancer growth and metastasis. Mol Cancer. 2022 Mar 10;21(1):70. doi: 10.1186/s12943-022-01538-4.
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