中药多组学策略发1区: 天津中医大以代谢组学和转录组学揭示金芪降糖片治疗2型糖尿病的作用及机制

原名：Integrated metabolomic and transcriptomic analysis reveals the effects and mechanisms of Jinqi Jiangtang tablets on type 2 diabetes

译名：综合代谢组学和转录组学分析揭示金芪降糖片治疗2型糖尿病的作用和机制

期刊：Phytomedicine

IF：6.7

发表时间：2024.08

通讯作者：王毅

通讯作者单位：天津中医药大学

JQJT 中用于治疗2型糖尿病的主要分析物如图1所示。空腹血糖及糖耐量受损是2型糖尿病的重要表现，胰岛素是调控血糖及脂质代谢的关键内分泌因子。

与2型糖尿病对照组相比，2型糖尿病模型组空腹血糖升高（P < 0.001），空腹胰岛素（FINS）水平明显降低（P < 0.001）。与2型糖尿病模型组相比，2型糖尿病JQJT-L组及JQJT-H组空腹血糖升高（P < 0.05）（图2A），但JQJT-L/H组空腹胰岛素水平与2型糖尿病模型组相近，无统计学差异（图2B）。

图1 JQJT 中用于治疗2型糖尿病的主要7种分析物。浓度为 20 μg/ml 的混合标准溶液(A) 和样品溶液 (B) 的代表性色谱图 1：新绿原酸，2：绿原酸，3：异槲皮苷，4：木犀草苷，5：异绿原酸 A，6：小檗碱，7：巴马汀。

与T2DM对照组相比，T2DM模型组0、15、30、60、90、120 min血糖水平及G-AUC均显著升高（P < 0.001）。与T2DM模型组相比，T2DM JQJT-L组和JQJT-H组0、15、30、60、90、120 min血糖水平及G-AUC均显著降低，且T2DM JQJT-L组30、90 min及T2DM JQJT-H组60 min血糖水平差异均有统计学意义（P < 0.05）（图2C、D）。

与T2DM对照组相比，T2DM模型组在ITT各时间点血糖均升高（P < 0.001）。与T2DM模型组相比，T2DM JQJT-L组和JQJT-H组各时间点血糖水平相似，I-AUC无差异（P>0.05）（图2E和F）。

这些结果表明JQJT可以降低小鼠的空腹血糖水平，改善糖耐量，改善T2DM。

2型糖尿病也与血脂代谢异常有关。

与2型糖尿病对照组相比，2型糖尿病模型组的TG、TC和LDL-C水平较高（P < 0.01），而HDL-C水平无明显差异（P > 0.05）。与2型糖尿病模型组相比，2型糖尿病JQJT-L组和JQJT-H组的LDL-C和TG水平明显降低（P < 0.01或P < 0.001）（图3B和D），而血清TC和HDL-C水平无明显差异（P > 0.05）（图3A和C）。这些结果表明JQJT具有降低血脂的作用。

肝脏是脂质代谢的重要器官。与T2DM对照组相比，T2DM模型组肝脏TG、TC、LDL-C和FFA水平升高（P < 0.05），TC和FFA水平有显著差异（P < 0.001），但肝脏HDL-C水平无显著差异（P > 0.05）。与T2DM模型组相比，T2DM JQJT-L组和T2DM JQJT-H组肝脏TC和TG水平降低（P < 0.05和P < 0.01）（如图4A和B所示），但肝脏HDL-C、LDL-C或FFA水平无差异（P > 0.05）（如图4C-E所示）。这些数据表明JQJT可能有助于降低肝脏脂质水平。

肝脏是糖原储存的重要场所，T2DM对照组肝叶结构清晰，肝索排列整齐，中央静脉周围有单层肝细胞，未见病理损伤。T2DM模型组肝细胞排列紊乱，肝脏内大量脂肪沉积，脂质空泡严重、广泛。T2DM JQJT-L组和T2DM JQJT-H组肝索排列虽也紊乱，但组织病理学改变较T2DM对照组改善，肝细胞内脂肪空泡减少，肝脏脂肪变性改善（图5），提表明JQJT促进肝糖原合成。

T2DM对照组肝糖原呈紫红色，含量较多，在肝脏内分布较散；与T2DM对照组相比，T2DM模型组肝糖原含量明显降低；T2DM JQJT-L组和T2DM JQJT-H组肝糖原含量升高，提示肝糖原合成可能增强（图6）。

6.血清代谢组学结果分析

从T2DM小鼠的PCA图谱（图7A、B）可以看出，正离子模式下T2DM对照组、T2DM模型组和T2DM JQJT组在二维和三维空间中的分布趋于分离，且分离趋势明显，说明三组间血清代谢物存在统计学意义的差异。进一步经PLS-DA分析（图7C、D）可知，T2DM小鼠各组血清代谢物之间的差异与PCA结果类似，正离子模式下T2DM对照组、T2DM模型组和T2DM JQJT组在二维和三维空间中完全分离。结果显示，对照组与模型组之间、模型组与2型糖尿病JQJT组之间的血清代谢物有明显差异。

T2DM对照组与T2DM模型组经OPLS-DA模型完全分离（R2Y=0.984，Q2=0.913），统计模型具有良好的解释和预测能力（如图8A、B所示）。T2DM模型组与T2DM JQJT组完全分离，R2Y=0.993，Q2=0.91，统计模型具有良好的解释和预测能力（如图8C、D所示）。

经过初步筛选，T2DM 对照组与模型组间差异代谢物共476种，模型组与T2DM JQJT组间差异代谢物共437种，三组间共有差异代谢物共217种。我们进一步通过HMDB中的m/z值对三组间共有的差异代谢物进行鉴定，确定代谢物的分子式。最终筛选出35个T2DM对照组、T2DM模型组和T2DM JQJT组共有的差异代谢标志物（表2）。其中，与T2DM对照组相比，T2DM模型组有12种代谢物上调，23种代谢物下调；与T2DM模型组相比，T2DM JQJT组有5种代谢物上调，30种代谢物下调；金芪降糖片干预后，有13种代谢物显著下调（T2DM对照组vs.模型组vs.T2DM JQJT组）（图9）。

表2 T2DM小鼠血清代谢物在三组间存在差异

7.肝脏转录组学结果分析

T2DM对照组与T2DM模型组间共有1046个DEGs，T2DM模型组有179个上调DEGs（红色），867个下调DEGs（蓝色），如图10A所示。T2DM模型组与T2DM JQJT组间共有942个DEGs（图10B），T2DM JQJT组有729个上调DEGs（红色），213个下调DEGs（蓝色）。如图10C所示，T2DM对照组和T2DM模型组的1046个DEGs中，T2DM模型组和T2DM JQJT组的328个DEGs和942个DEGs重叠，提示JQJT对T2DM模型的改善作用可能主要通过调控这328个基因来实现。图10中的热图聚类分析也显示，在这328个DEGs中，T2DM对照组和T2DM JQJT组的三个基因表达更为相似，与T2DM模型组有显著差异，如补充表1所示。

8.血清代谢组学与肝脏转录组学分析相关性分析

我们对血清代谢组学筛选出的35种差异代谢物与328个不同的基因进行鉴定。经计算，我们发现35种差异丰度代谢物与284个差异表达基因存在相关性（P < 0.05，相关性绝对值> 0.8），共有628对不同代谢物-不同基因对呈正相关，327对不同代谢物-不同基因对呈负相关，具体关系如图11所示。

提取相关差异丰富代谢物和差异表达基因，我们利用MetaboAnalyst 5.0的通用通路分析功能进行潜在通路富集和构建，最终富集36条相关通路，其中富集P < 0.05的通路有8条，分别为视黄醇代谢、类固醇生物合成、花生四烯酸代谢、糖酵解和糖异生、组氨酸代谢、丙酮酸代谢、柠檬酸循环、乙醛酸代谢和二羧酸代谢（如表3所示）。

9.JQJT对2型糖尿病小鼠糖脂通路指标mRNA及蛋白表达的影响

涉及引物如表1所示。与2型糖尿病对照组相比，2型糖尿病模型组IRS-1 mRNA及蛋白水平明显降低（P < 0.05或P < 0.01）；与2型糖尿病模型组相比，JQJT-L组和JQJT-H组IRS-1 mRNA及蛋白水平明显升高（P < 0.05或P < 0.01）（图12A、B）；与2型糖尿病对照组相比，2型糖尿病模型组pPI3K及pAKT表达水平明显降低（P < 0.05）。与T2DM模型组相比，T2DM JQJT-L组和JQJT-H组pPI3K和pAKT表达水平升高（P < 0.05或P < 0.01）（图12C和D）。

表1 目标基因引物序列

高脂肪和STZ诱导的胰岛素信号在T2DM小鼠中降低，而JQJT通过增加IRS-1的mRNA和蛋白质表达、PI3K和AKT的磷酸化，增加了胰岛素敏感性并调节T2DM小鼠的胰岛素信号通路。

与T2DM对照组相比，模型组GLUT2蛋白表达水平降低（P < 0.01）。与模型组相比，T2DM JQJT-L组和JQJT-H组GLUT2蛋白表达水平升高（P < 0.05）（图13A）。

与T2DM对照组相比，T2DM模型组糖酵解途径关键酶HK1和PFKM的mRNA水平降低（P < 0.05），HK1水平无明显变化，PFKM蛋白表达水平降低（P < 0.05）。与T2DM模型组相比，T2DM JQJT-L组和JQJT-H组HK1和PFKM的mRNA水平升高（P < 0.05），HK1蛋白表达水平无明显变化，PFKM蛋白表达水平升高（P < 0.05）（图13B，C，D）。

高脂及STZ诱导的T2DM小鼠肝脏葡萄糖转运和糖酵解均降低，而JQJT通过增加肝脏GLUT2和关键糖酵解酶的表达来改善T2DM小鼠的糖代谢紊乱。

与2型糖尿病对照组相比，2型糖尿病模型组pGSK-3β蛋白表达水平升高（P < 0.01）。与2型糖尿病模型组相比，2型糖尿病JQJT -L组和JQJT -H组pGSK-3β蛋白表达水平降低（P < 0.05）（图14A）。

与T2DM对照组相比，T2DM模型组GYS mRNA和蛋白表达水平降低（P < 0.001）。与T2DM模型组相比，T2DM JQJT-L组和JQJT-H组GYS mRNA和蛋白表达水平升高（P < 0.05）（图14B，C）。

高脂和STZ诱导的肝脏GSK-3β磷酸化增加和GYS水平降低抑制了肝糖原合成，而JQJT通过降低GSK-3β磷酸化和增加GYS表达促进小鼠肝脏糖原合成。

与2型糖尿病对照组相比，2型糖尿病模型组PPARα的mRNA和蛋白表达水平降低（P < 0.001）。与2型糖尿病模型组相比，2型糖尿病JQJT -L组和JQJT -H组PPARα的mRNA和蛋白表达水平升高（P < 0.001）（图15A、B）。

与T2DM对照组相比，T2DM模型组Lpl和CPT1A表达水平降低（P < 0.05）；与T2DM模型组相比，T2DM JQJT-L组和JQJT-H组Lpl和CPT1A表达水平升高（P < 0.05）（图15C）。

高脂和STZ诱导T2DM小鼠肝脏PPARα、Lpl和CPT1A表达降低，脂质代谢（尤其是甘油三酯和脂肪酸）降低；JQJT通过增加PPARα、Lpl和CPT1A的表达，调节肝脏甘油三酯的分解代谢和脂肪酸的利用，从而改善肝脏脂质水平。

随着生活水平的不断提高，很多人处于亚健康状态。T2DM是目前国内乃至世界范围内最常见的代谢性疾病，影响非常大，而IR和胰腺β细胞功能受损导致胰岛素水平异常从而促使不同程度的胰岛素缺乏是导致T2DM的两个关键因素。血糖过高可能导致血管内皮受损，导致糖尿病心肌病、糖尿病脑病、肾病、大血管和小血管视网膜病变，甚至器官衰竭，对患者的生活造成重大影响，增加经济负担，同时机体处于不利于日常生活的病理状态，但发病机制尚不明确。中医药的益处已被接受并广泛应用于许多临床疾病的治疗，特别是一些慢性疾病（T2DM），疗效显著。临床和基础研究均已证实JQJT对T2DM有疗效，但其作用机制尚待进一步阐明。因此，我们利用T2DM小鼠模型评估JQJT在改善T2DM中的作用。我们采用多组学联合分析方法揭示JQJT的作用机制并验证关键通路，希望本研究能充分揭示JQJT在T2DM治疗中的作用机制，为更有效的T2DM临床治疗提供参考。

糖脂代谢异常是T2DM的常见症状。已有多项临床及动物研究显示JQJT是治疗2型糖尿病的有效药物，并验证了其作用机制，但这些研究仅针对某一特定靶点或通路进行，研究成果不足，为更好地了解JQJT治疗2型糖尿病的作用机制，我们采用转录组学和代谢组学技术，从多组学角度进行研究，并结合多组学结果进行验证。

为了进一步探究JQJT改善2型糖尿病的机制，我们首先采用UPLC-Q-TOF-MS检测代谢物。结果显示，T2DM对照组、T2DM模型组和T2DM JQJT组之间的血清代谢物存在显著差异。我们鉴定出35种差异代谢标志物，瓜氨酸与T2DM的关系备受关注。氧化应激可能是T2DM的重要病理基础，瓜氨酸是一种有效的抗氧化剂，补充瓜氨酸可以降低2型糖尿病患者的FBG水平和氧化应激水平，并增加血清亚硝酸盐/硝酸盐水平。一项临床研究还表明，补充瓜氨酸可以改善肥胖和T2DM患者的血糖稳态和几种脂质水平以及炎症生物标志物的水平。一氧化氮（NO）与2型糖尿病及其并发症有关，而瓜氨酸是NO产生的前体。糖尿病性心肌病可能导致患者心力衰竭，影响心脏功能，是糖尿病最重要的并发症之一，其发病机制与NO介导的内皮损伤密切相关。研究表明，补充瓜氨酸可减少2型糖尿病小鼠的心肌梗死面积，改善心脏功能和冠状动脉血流。最近的临床研究表明，补充微量营养素（瓜氨酸）可能降低心血管风险。此外，NO是能量和脂质代谢的必需调节剂，也有研究表明，瓜氨酸与阿托伐他汀联合使用可防止小鼠肥胖的发展，维持血糖稳态并抑制肝脏脂肪生成。瓜氨酸也被证明在糖尿病视网膜病变患者中升高，但它是否是这种疾病的标志物需要进一步研究。因此，瓜氨酸是对抗 2 型糖尿病的重要工具，JQJT 很可能是调节瓜氨酸改善 2 型糖尿病的有效药物。

我们应用转录组学技术检测小鼠肝组织中的差异表达基因，以研究 JQJT 如何治疗 2 型糖尿病的最全面和准确的机制，我们对 328 个基因的通路丰度分析表明，JQJT 可能通过调节葡萄糖和脂质代谢相关通路来改善 2 型糖尿病，例如糖酵解/糖异生通路、PI3K/AKT、p450、MAPK 和胰岛素信号通路。结果如图 16 所示。IRS/PI3K/AKT 信号传导是调节糖脂代谢的重要途径，稍后将详细讨论。MAPK通路是维持血糖稳态的重要途径。MAPK激活其下游靶点NF-κB，NF-κB刺激增加下游炎症因子水平，促进肝脏IR。在T2DM中，MAPK还能诱导胰腺β细胞死亡。抑制MAPK表达可有效改善T2DM小鼠的氧化应激、减轻炎症反应、改善肠道功能。我们前期的研究表明T2DM小鼠存在肠道菌群失衡，改善肠道菌群也可能是治疗T2DM的一种新途径。JQJT很可能成为一种调节肠道菌群改善2型糖尿病的新型药物，有待在本部分研究中进一步探讨。

代谢组学与转录组学联合分析也是探索疾病生物标志物和潜在治疗药物靶点的重要技术。综上所述，我们对代谢物和差异基因的结果进行了合并分析，提取了各类相关代谢物和DEG，然后利用MetaboAnalyst 5.0的组合通路分析功能进行富集和构建潜在通路，最终富集了36条相关通路，其中P < 0.05的通路8条，分别为视黄醇代谢、类固醇生物合成、糖酵解和糖异生、花生四烯酸代谢、组氨酸代谢、柠檬酸循环、丙酮酸代谢、二羧酸和乙醛酸代谢。总体而言，我们对这些通路进行了分类，8条通路中有2条与葡萄糖代谢有关，包括糖酵解和糖异生途径和丙酮酸代谢；其中三条与脂质代谢有关，包括视黄醇代谢、花生四烯酸代谢和类固醇生成，其中两条与乙酰辅酶A代谢有关，即柠檬酸循环和乙醛酸和二羧酸代谢；一条与氨基酸代谢有关，主要与组氨酸代谢有关。由于乙醛酸和二羧酸代谢主要发生在植物和微生物中，它们可以将脂肪酸分解成乙酰辅酶A，然后用于葡萄糖合成，因此不再赘述。总之，这些结果表明JQJT可能主要通过调节代谢相关途径来增强JQJT对小鼠2型糖尿病的作用。

我们利用WB和PCR检测小鼠肝脏中参与葡萄糖和脂质通路的靶点，结果显示高脂+STZ诱导的T2DM小鼠IRS-1表达降低，PI3K和AKT磷酸化水平降低，提示胰岛素信号水平降低；JQJT通过增加IRS-1表达和PI3K和AKT磷酸化水平，增加T2DM小鼠的胰岛素敏感性和胰岛素信号水平。糖脂代谢离不开胰岛素的作用，在肝脏中，胰岛素的主要作用是参与葡萄糖（糖原）、脂质、蛋白质的代谢，可以抑制肝脏中的糖异生，抑制脂肪组织中的脂肪分解，促进脂肪生成和脂肪沉积。PI3K/Akt信号是目前研究较多的与胰岛素相关的经典通路。胰岛素通过一系列反应与胰岛素受体结合，PI3K被募集并磷酸化胰岛素结合位点，随后Akt在Thr308和Ser473处磷酸化，同时向下游多种底物发出信号，调节细胞生长、糖脂代谢等。胰岛素是葡萄糖分解和糖原合成的关键调节因子，负责维持血糖稳态。肝脏负责体内约30%的葡萄糖代谢，是维持体内葡萄糖稳态的主要贡献者。肝细胞通过细胞表面葡萄糖转运体2（GLUT2）吸收葡萄糖，GLUT2与胰岛素受体（INSR）形成INSR-GLUT2复合物，介导胰岛素对肝葡萄糖的调节。餐后血浆胰岛素浓度升高诱导GLUT2内化将葡萄糖转运至肝脏，通过刺激肝脏增加糖原储量来抑制肝脏糖异生。GLUT2还在调节肝脏转录因子葡萄糖反应因子的调节剂基因活性方面发挥作用，从而激活糖酵解途径，促进葡萄糖分解代谢。糖酵解通过分解葡萄糖为肝细胞提供能量，该途径中葡萄糖的利用主要受三种关键限速酶的调控，这三种酶分别是HK、磷酸果糖激酶(PFKM)以及肝型丙酮酸激酶(PKL)。肝糖原合成受胰岛素、胰高血糖素和葡萄糖的调控，它们通过影响GSK-3β和GYS的活性来控制糖原合成。正常情况下，肝葡萄糖是在一夜短暂禁食10-14小时后由糖原分解和糖异生产生的，最终被释放到血液循环中。IR时血糖升高的一种解释是，在IR的早期（preDM），高胰岛素水平应能保证血糖水平保持正常，但由于分泌胰高血糖素的胰岛α细胞也经历IR，所以本应被血糖和高胰岛素抑制的胰高血糖素水平没有得到充分抑制。肝脏对胰高血糖素的敏感性降低导致肝糖原分解过多，释放出更多的葡萄糖，而这些葡萄糖无法被人体正常利用，从而导致葡萄糖大量蓄积，最终升高循环葡萄糖水平。PAS染色结果显示，高脂+STZ诱导的T2DM小鼠FBG水平升高，糖耐量受损，肝糖原显著减少。在代谢组学和转录组学联合分析预测的通路中，我们预测了2条与葡萄糖代谢相关的通路，即糖酵解、糖异生和丙酮酸代谢。机制研究表明，在T2DM小鼠中，GLUT2、PFKM和GYS表达下调，GSK-3β磷酸化上调；这表明高脂+STZ诱导的小鼠T2DM可能通过下调GLUT2、PFKM和GYS表达和上调GSK-3β磷酸化导致肝脏糖酵解和糖原合成水平降低，从而导致空腹血糖水平升高、糖耐量受损和肝糖原减少，而JQJT可以有效改善这些情况。

2型糖尿病患者代谢紊乱是典型的代谢异常。过量脂类摄入导致肝脏脂毒性增加，促进IR的发生；同时，IR引起的高胰岛素血症抑制脂肪分解，促进肝脏脂肪变性。脂质升高与IR互相促进，形成恶性循环。肝脏是体内负责脂质代谢的重要部位，脂肪酸代谢是脂质代谢的一部分。PPARα是刺激脂肪酸氧化利用的关键转录因子，膳食中脂肪酸的摄入可调控PPARα，促进脂肪酸的代谢和分泌。脂蛋白脂肪酶（LPL）催化甘油三酯的分解代谢，产生的脂肪酸被组织消耗作为能量，并与控制甘油三酯的利用和储存有关。LPL缺乏可导致严重的高甘油三酯血症。系统性LPL缺乏已证明会导致葡萄糖耐受性下降、血浆脂质水平升高，并伴有组织特异性IR。肝脏对血浆游离脂肪酸（FFA），尤其是短链脂肪酸的摄取比静息肌肉高2-3倍。肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）调节肝线粒体中脂肪酸的β-氧化，催化酰基辅酶A转化为酰基肉碱，酰基肉碱可跨膜进入线粒体并转化为脂肪酸进行氧化分解代谢。一项研究表明，当FFA输入体内时，肝脏对FFA的摄取和利用会增强，从而导致肝脏葡萄糖摄取减少，糖异生增加。这表明肝脏脂质代谢异常也会导致肝脏葡萄糖代谢异常。我们的研究结果还显示，T2DM小鼠的血浆和肝脏脂质水平升高；以及严重的肝脏脂肪变性。代谢组学和转录组学联合分析预测的通路中，有3条通路与脂质代谢有关，分别是视黄醇代谢、花生四烯酸代谢和类固醇生物合成。机制研究发现，T2DM小鼠PPARα、Lpl和CPT1A表达下调，提示高脂+STZ诱导的T2DM可能通过PPARα、Lpl和CPT1A的下调影响肝脏和血浆脂质水平，导致肝脏脂肪分解水平下降、肝脏脂质堆积和严重脂肪萎缩。JQJT可能通过上调PPARα、Lpl和CPT1A的表达，特别是甘油三酯和脂肪酸代谢，提高肝脏脂质代谢水平，从而降低肝脏脂质水平，改善肝脏脂肪变性。

JQJT降低T2DM小鼠血糖和血脂水平，改善胰岛素抵抗和糖耐量，改善肝脏脂肪变性。综合转录组学和代谢组学结果表明JQJT具有通过调节糖脂代谢途径改善2型糖尿病的潜力，WB和PXR结果也表明JQJT通过上调GLUT2、PFKM和GYS水平，下调GSK-3β的磷酸化，调节糖酵解和糖原合成途径中相关酶的表达，最终调节FBG水平和糖耐量。JQJT上调PPARα、Lpl和CPT1A的表达，增加肝脏脂质代谢，特别是甘油三酯和脂肪酸代谢，从而降低肝脏脂质水平，改善肝脏脂质脂肪变性。综上所述，JQJT可能通过肝脏糖脂代谢途径改善2型糖尿病，如图17所示。

首先，本研究探讨了JQJT对T2DM的改善作用，但通过肝脏染色，虽然HE染色揭示了preDM和T2DM小鼠肝脏脂肪变性的变化，但为了对脂质蓄积进行特异性观察和统计量化，我们未进行油红O染色，肝脏PAS染色也未进行定量统计分析。其次，本研究通过整合代谢组学和转录组学来评估JQJT对T2DM的作用机制，由于数据量巨大，无法单独分析每一项研究的结果，只能通过相关性分析从预测代谢途径的角度来分析JQJT对T2DM的改善作用机制。第三，由于涉及的途径众多，本研究并未对所有的糖脂途径进行逐一比较分析，仅基于葡萄糖分解代谢和储存以及脂肪酸分解代谢和储存两条主要途径进行机制探讨。最后，本研究缺乏进一步的基因敲除或体外细胞验证，以进一步阐明 JQJT 改善 2 型糖尿病的机制。