原名：Widely targeted metabolomic analysis reveals metabolite changes induced by incorporating black tea fermentation techniques in oolong tea processing for quality improvement

译名：广靶代谢组学揭示乌龙茶加工中引入红茶发酵技术以提高质量所引起的代谢产物变化

期刊：Food Chemistry

IF：8.5

发表时间：2024.07

通讯作者：赖兆祥、孙世利

通讯作者单位：广东省农业科学院

传统的感官评价方法被用于评估不同工艺处理的乌龙茶的感官品质（见图1和表S1）。对照组（直接终止氧化，进行揉捻成型并干燥）的茶样呈绿黄色，颗粒紧实，汤色明亮的蜜黄色，花香和果香浓郁，茶汤涩味明显，滋味单调，叶底绿中带红边，叶片质地柔软，综合品质评分为86分。FO-L（短时发酵1次揉捻乌龙茶组——轻揉捻）组的茶样呈黄绿色，带有少量红棕色，颗粒紧实且比例协调，汤色橙黄明亮，花香和果香浓郁，茶汤微涩，滋味醇厚，叶底柔软明亮，整体品质评分为89分。FO-H（短时发酵5次揉捻乌龙茶组——重揉捻）组的茶样外观紧实均匀，颜色深绿油润带有红棕色，汤色橙红明亮，花香和果香浓郁，带有甜味，滋味醇厚，叶底厚实明亮，综合品质评分为92分。总之，将红茶发酵技术融入乌龙茶加工中，并未影响乌龙茶的香气，而且显著提升了乌龙茶的整体口感，尤其是减少了涩味，增加了醇厚度。

乌龙茶以其独特的“品种香”著称，这与茶叶加工过程中受到的机械损伤密切相关。在乌龙茶的生产中，引入红茶的包裹揉捻工艺增加了茶叶内部结构的损伤程度。这不仅有助于茶叶内化学成分的释放，而且为后续的发酵过程创造了有利条件。与轻揉捻的FO-L组相比，重揉捻的FO-H组乌龙茶口感更加醇厚、柔和、顺滑，茶汤色泽更加明亮，滋味更加浓郁且新鲜，从而提升了乌龙茶的品质。FO-H组的乌龙茶在风味和品质上表现最佳。

为了进一步分析红茶发酵工艺对乌龙茶汤品质的影响，我们使用分光光度计测量了茶汤的色差。对照组（Control）的茶汤亮度较高，而FO-L和FO-H组的茶汤亮度较低，L^*值分别为95.27、92.36和92.77（图1G）。对照组的茶汤呈现黄绿色，a^*和b^*值分别为-2.09和8.71。FO-L和FO-H组的茶汤主要呈现黄红色，a^*值分别为-1.83和-1.37，b^*值分别为16.35和16.83（图1H和I）。结果表明，红茶发酵工艺的引入显著增加了乌龙茶的a^*和b^*值，增强了乌龙茶的色调。茶汤颜色的加深是由于多酚氧化酶和过氧化物酶催化的多酚类、茶黄素和茶红素的氧化聚合作用。这些生化变化不仅影响茶汤的颜色，也影响茶的风味。与对照组相比，FO-L和FO-H组显著增加了茶红素和茶褐素的含量，使茶汤颜色更加红亮，结果与茶汤色差值的分析一致（表S2）。

为了深入分析不同工艺对乌龙茶汤有效味道的影响，实验中采用了电子舌技术。电子舌的酸味阈值为-13，咸味阈值为-6，其他指标的阈值均为0（见图1C）。在三组茶样的味道指标中，只有酸味低于味道阈值，表明茶样中没有有效的酸味（见图1B）。三组茶样在咸味、涩味及涩味余味上存在显著差异。与对照组相比，FO-L组和FO-H组的涩味和涩味余味显著降低，说明在乌龙茶加工中引入红茶发酵技术（BTF）显著减少了乌龙茶的涩味和涩味余味（见图1D）。电子舌的检测结果与传统感官评价结果一致。总体而言，引入红茶发酵技术可以提升乌龙茶的品质。此外，FO-H组的鲜味、咸味和醇厚度均强于FO-L组，表明重揉捻工艺相比轻揉捻工艺更显著地改善了乌龙茶的口感和品质（见图1E）。

主成分分析（PCA）对茶样的有效味道进行了分析，结果显示对照组在第一主成分（PC1）上与FO-L组和FO-H组存在显著差异（见图1F）。涩味、咸味和涩味余味是PC1对味道的主要贡献因素，这表明引入红茶发酵技术能显著减少乌龙茶中的涩味。在第二主成分（PC2）上，FO-H组与对照组和FO-L组有显著不同。PC2的主要贡献为咸味、醇厚度和鲜味。这一结果表明，短时发酵和重揉捻工艺能显著提升乌龙茶的味道并改善其品质。乌龙茶的电子舌分析结果与传统感官评价结果一致。综合来看，在乌龙茶生产过程中引入BTF技术可以提升乌龙茶的品质，使茶汤色泽橙黄明亮，口感清新而不涩。

2. 对乌龙茶中非挥发性代谢物引入红茶发酵技术（BTF）效果的分析

为了阐明通过引入红茶发酵技术（BTF）所利用的关键非挥发性代谢物，以提升乌龙茶的口感品质，本研究基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）技术，对三组乌龙茶样本进行了非挥发性代谢物的分析，共鉴定出1896种非挥发性代谢物，包括404种黄酮类化合物、295种酚酸、188种脂质、166种氨基酸及其衍生物、155种生物碱、115种萜类化合物、99种有机酸、92种木脂素和香豆素、67种核苷酸及其衍生物、50种单宁、10种醌类化合物，以及255种其他代谢物（见图2A）。乌龙茶中的主要代谢物详见表S3。通过质谱检测的质量控制样品（QC）的总离子色谱图（TIC）曲线重叠度高，表明UPLC-MS/MS具有高稳定性（见图S1A和B）。变异系数（CV值）<0.5的物质比例超过85%，CV值<0.3的物质比例超过75%，表明实验数据稳定（见图S1C）。此外，茶样间的相关性分析显示，组内样本间的皮尔逊相关系数接近1，表明本研究中的差别代谢物具有良好的重复性和可靠性（见图S1D）。

在这些代谢物中，共鉴定出168种风味代谢物，包括11种黄酮类化合物、22种酚酸、2种脂质、40种氨基酸及其衍生物、19种生物碱、25种有机酸、1种木脂素和香豆素、14种核苷酸及其衍生物、9种单宁以及25种其他代谢物。其中，苦味物质含量最高（75种，占44.64%），其次是甜味物质（30种，占17.86%）、涩味物质（29种，占17.26%）、酸味物质（19种，占11.31%）、鲜味物质（8种，占4.76%）、其他特殊味感物质（6种，占3.57%）以及咸味物质（1种，占0.6%）（见图2B）。风味代谢物的鉴定为进一步分析通过引入红茶发酵技术（BTF）改善乌龙茶口感品质的关键差异代谢物奠定了基础。

基于1896种非挥发性代谢物，我们进一步进行了化学计量学分析，以明确各组之间的非挥发性代谢物差异。主成分分析显示，三组茶样和质量控制样品（QC）之间存在显著差异（p < 0.01）。三个主要成分（PC1、PC2和PC3）的方差分别为38.08%、21.92%和9.05%，表明三组茶样主要在PC1轴上表现出显著的代谢组学差异（见图2C）。对照组位于PC1的正区域，而FO-H组和FO-L组位于PC1的负区域，这表明在乌龙茶加工过程中引入红茶发酵技术（BTF）显著影响了非挥发性代谢物的积累。FO-H组位于PC3的正区域，而FO-L组位于PC3的负区域，这表明不同的揉捻工艺也显著影响了乌龙茶的非挥发性代谢物。

正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型被应用于进一步确定组内样本代谢物组成的差异。预测参数（R²Y=0.997, p=0.005）和预测优良度（Q²=0.917,p < 0.005）的OPLS-DA评估模型表明该模型稳定可靠，可用于进一步筛选差异代谢物（见图S1E）。对照组、FO-H组和FO-L组分别位于横轴的左侧、中间和右侧，表明组间存在明显分离，尤其是对照组与引入红茶发酵技术（BTF）的乌龙茶（FO-L和FO-H）之间（见图2D）。相比之下，不同揉捻程度的乌龙茶之间的差异较小。这些结果表明，短时发酵过程显著改变了乌龙茶的非挥发性代谢物，其次是揉捻程度。此外，所有代谢物和样本的聚类分析显示组间存在显著差异，尤其是对照组与引入BTF技术的乌龙茶之间（见图2E）。

为了明确引入红茶发酵技术（BTF）对乌龙茶代谢物的影响，本研究对各组乌龙茶的关键差异代谢物进行了分析。更具体地说，根据正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型中变量重要性投影（VIP ≥ 1）以及单变量统计分析中差异倍数（FC） ≥2 或差异倍数 ≤0.5的原则，我们筛选出564种显著差异代谢物，其中比例最高的是黄酮类化合物（22.87%），其次是酚酸（20.21%）和氨基酸及其衍生物（7.62%）（见图3A）。在差异代谢物中，有43种与味道相关的代谢物，包括9种氨基酸及其衍生物、9种酚酸、8种有机酸、6种单宁、5种生物碱、2种黄酮类化合物、2种核苷酸及其衍生物，以及种个其他物质。与味道相关的差异代谢物对风味的贡献见图3B。

我们在FO-L组与对照组之间观察到407种差异物质（包括33种风味代谢物），其中有144种上调物质和263种下调物质（见图3E）。我们在FO-H组与对照组之间观察到445种差异物质（包括33种风味代谢物），其中有153种上调物质和292种下调物质（见图3F）；在FO-H组与FO-L组之间观察到70种差异物质（包括8种风味代谢物），其中有42种上调物质和28种下调物质（见图3G）。各比较组的维恩图分析显示，仅有16种代谢物在各比较组中普遍存在，表明三组乌龙茶的差异代谢物具有显著差异（见图3C）。引入红茶发酵技术（包括短时发酵和不同揉捻程度）可以显著改变乌龙茶中差异代谢物的数量和相对含量。

在乌龙茶的发酵过程中，茶叶中的儿茶素被氧化并二聚形成茶黄素，随后聚合成茶红素和茶褐素。发酵程度越高，茶黄素的含量越高，而个别儿茶素和总酚类物质的含量则越低。这与本研究的结果一致。与对照组相比，引入红茶发酵技术（BTF）的乌龙茶（FO-L和FO-H）显著改变了306种差异代谢物。特别是，在短时发酵过程中，黄酮类化合物和酚酸是变化的主要代谢物类别（见图3C和D）。我们对每组比较中差异倍数最高的前20种代谢物进行了分析。与对照组相比，引入红茶发酵技术（BTF）的乌龙茶（FO-L和FO-H）显著上调了差异代谢物4-O-乙酰-3-咖啡酰-2-甲基-D-赤藓糖醇酸（iso-2）、栗苷B [山柰酚-3-O-(4″,6″-二对香豆酰)甘露糖苷]、1-[(2E)-3-(4-甲氧基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]吡咯烷、白杨素、(5S,8R,9Z,12Z)-5,8-二羟基-9,12-十八碳二烯酸的含量。而诸如Carbadienoic acid和儿茶素-5-O-葡萄糖苷、1-O-(6’-O-阿魏酰)葡萄糖苷-3-O-咖啡酰奎宁酸、(2R,3R,4S,5S,6R)-2-[[(1R,2R,4R)-2,4-二羟基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]氧基]-6-(羟甲基)氧烷-3,4,5-三醇、N′,N″,N″‘-对香豆酰-肉桂酰-咖啡酰精胺、松柏苷和3-肉桂酰-5-咖啡酰奎宁酸等差异代谢物的含量显著降低（见图S2和S3）。其中白杨素具有甜味，是一种在蜂蜜、花朵和茶叶中发现的天然物质。白杨素具有抗氧化、抗炎等多种生物活性。N′,N″,N″‘-对香豆酰-肉桂酰-咖啡酰精胺和松柏苷具有苦味。然而，这些物质的风味阈值仍然不确定。因此，需要对风味代谢物进行进一步分析，以阐明通过短时发酵减少乌龙茶汤的苦味和涩味、提高品质的关键差异代谢物。

我们在差异代谢物中已知的风味代谢物进行了分析（表1）。与对照组相比，短时发酵组（FO-H和FO-L）中的一些涩味特征成分，如樱桃苷、没食子儿茶素和没食子酸甲酯的含量分别降低了1.09倍、1.07倍和1.06倍，而原花青素B3、没食子酸乙酯、茶黄素-3'-没食子酸酯、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素和香草酸的含量分别增加了1.18倍、2.46倍、1.62倍、1.62倍、1.07倍和1.72倍。基于各种涩味成分的相对含量，通过短时发酵减少乌龙茶涩味的关键差异代谢物是樱桃苷、没食子儿茶素和没食子酸甲酯。这些发现与先前的研究一致，表明发酵过程中儿茶素的氧化或分解可以减少涩味，使茶汤更加醇厚。与对照组相比，短时发酵组（FO-H和FO-L）减少了一些苦味特征成分，如新绿原酸（Log₂FC: −2.59）、L-组氨酸（Log₂FC: −1.36）和L-脯氨酰-L-苯丙氨酸（Log₂FC: −1.24），同时上调了一些苦味特征成分，如三甲胺（Log₂FC: 1.66）、没食子酸辛酯（Log₂FC: 1.88）、2′,4′,6′-三羟基乙酰苯（Log₂FC: 1.62）和4-氨基水杨酸（Log₂FC: 1.38）。由于茶汤中一些上调的苦味物质含量较低，对茶汤的苦味没有显著影响，因此短时发酵过程可以减少乌龙茶汤的苦味。此外，我们在FO-H组中检测到了3-(3-甲氧基苯基)-1-(吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮、Artecalin、黑麦草内酯、5-甲氧基肉桂基吡咯烷、3,4,5-三-O-没食子酰莽草酸、维生素D3、松三糖O-鼠李糖苷和芫花叶甙，而在对照组中未检测到。其中，黑麦草内酯具有鲜味、甜味和微咸味。因此，黑麦草内酯是使引入红茶发酵技术（BTF）的乌龙茶汤具有更加丰富、醇厚和顺滑口感的关键代谢物。黑麦草内酯具有抗衰老和抗炎作用。将红茶发酵技术应用于乌龙茶的生产可能增强乌龙茶的抗衰老和抗炎作用。综上所述，通过短时发酵改善乌龙茶品质的关键代谢物是樱桃苷、没食子儿茶素、没食子酸甲酯和黑麦草内酯。

为了研究不同组代谢物的相对含量变化趋势，我们对筛选出的差异代谢物进行了K-均值聚类分析。亚类2（51种差异代谢物）、亚类5（77种差异代谢物）和亚类8（215种差异代谢物）的代谢物相对含量随发酵程度的增加而呈现下降趋势（见图4）。其中，FO-L组与FO-H组之间亚类8的变化趋势不明显。相反，亚类6（66种差异代谢物）的代谢物相对含量随发酵程度的增加而呈现上升趋势。

在亚类2、5和8中，由于短时发酵过程，20种风味差异代谢物的含量降低。这些主要包含了如没食子酸甲酯、樱桃苷和没食子儿茶素等涩味代谢物。同样也包括了新绿原酸、异烟酸、L-甘氨酰-L-异亮氨酸、酪氨酸-甘氨酸、N-甘氨酰-L-亮氨酸、L-组氨酸和L-脯氨酰-L-苯丙氨酸等苦味代谢物。甲基没食子酸是一种酚酸化合物，它能与口腔中的蛋白质结合，引起涩感和涩味。相比短时发酵的乌龙茶，长时间发酵的乌龙茶中儿茶素含量较低。儿茶素含量影响乌龙茶的醇厚度和鲜爽度。儿茶素是一种儿茶素类型，是茶汤涩味的主要贡献者之一，其含量直接影响茶汤的涩味强度。此外，儿茶素能与茶氨酸结合，影响茶汤的鲜味和甜味。因此，短时发酵过程可以减少乌龙茶汤中的苦味和涩味代谢物，从而提升乌龙茶的品质。

在亚类6中，由于短时发酵，9种风味代谢物的相对含量有所增加。这些主要包含了涩味代谢物，如原花青素B3、没食子酸乙酯、茶黄素-3'-没食子酸酯、茶黄素-3-没食子酸酯和茶黄素。原花青素（如原花青素B3）和没食子儿茶素（如没食子酸乙酯）通过微生物酯酶的作用逐渐水解为非儿茶素和没食子酸。这些变化导致茶的风味发生显著变化，如木香、陈香以及醇厚和甜味。茶黄素（如茶黄素-3'-没食子酸酯、茶黄素-3-没食子酸酯和茶黄素）与茶多酚、氨基酸等物质的相互作用可以增强茶的鲜味和甜味。因此，这些由短时发酵过程增加的涩味风味物质可以间接提升乌龙茶的新鲜感和醇厚甜味。此外，由于短时发酵，三种苦味代谢物的相对含量也有所增加，如腺嘌呤、次黄嘌呤和4-氨基水杨酸。茶中的嘌呤生物碱（腺嘌呤、次黄嘌呤）含量较低，它们的直接风味贡献不如茶中的其他化学成分显著（如茶多酚、氨基酸和其他化合物）。因此，它们对茶汤苦味的贡献较低。苯甲酸是亚类6中的酸性代谢物。在茶叶加工过程中，特别是在发酵过程中，苯甲酸可能与其他化合物反应生成新的风味化合物，从而影响茶的最终风味特性。

为了阐明引入红茶发酵技术（BTF）对乌龙茶代谢途径的影响，我们对445种差异代谢物进行了KEGG富集分析（见图S5）。共涉及74条代谢途径被涉及，它们归属于3个模块：代谢（71条途径）、遗传信息处理（1条途径）和环境信息处理（2条途径）。根据P值显示的富集程度，前20条途径如图S5B所示，并结合了差异风味代谢物的富集分析，包括黄酮和黄酮醇的生物合成、类黄酮生物合成、D-氨基酸代谢、芪类化合物、二萜类化合物和姜黄素生物合成、半乳糖代谢、光合生物中的碳固定、次级代谢物的生物合成和脂肪酸代谢，被认为是研究短时发酵过程引起的乌龙茶代谢物演化机制的潜在目标。

在黄酮和黄酮醇生物合成以及类黄酮生物合成途径中，已注释代谢物的动态变化聚类热图显示了不同组代谢物的变化模式（见图S5D和E）。乌龙茶的短时发酵过程显著影响了涩味差异代谢物的调节，包括樱桃苷、2-呋喃甲酸和儿茶素。樱桃苷是柚皮素的黄酮单葡萄糖苷形式，它可以调节肠道菌群的失衡。樱桃苷的产生可以减少柚皮素的苦味。涩味差异代谢物主要集中在类黄酮生物合成和次级代谢物生物合成的代谢途径中。此外，短时发酵调节的苦味差异代谢物包括吡咯-2-羧酸、L-组氨酸和色胺，它们主要富集在D-氨基酸代谢和次级代谢物生物合成的代谢途径中。具有酸味差异的代谢物富集在脂肪酸代谢和次级代谢物生物合成中，尤其是丙二酸、己二酸和绿原酸。与甜味相关的差异代谢物富集在半乳糖代谢和次级代谢物生物合成的代谢途径中，包括D-蔗糖和5-氧化脯氨酸。次级代谢物生物合成还包括鲜味代谢物（L-天冬氨酸）和咸味代谢物（羟基丙酮酸）。总之，引入红茶发酵技术（BTF）的工艺改善乌龙茶品质主要是通过改变茶叶中类黄酮生物合成和次级代谢物生物合成的代谢途径，从而减少涩味，增加茶汤的醇厚度。

在乌龙茶的生产过程中，引入红茶发酵技术（BTF）的重揉捻技术，不仅有助于通过增加茶叶内部结构的损伤程度来释放茶叶内的化学成分，而且有助于为后续的发酵过程创造条件。重揉捻乌龙茶的发酵程度比轻揉捻乌龙茶更强。与轻揉捻的FO-L组相比，重揉捻的FO-H组主要显著改变了70种差异代谢物，主要是氨基酸及其衍生物、生物碱和酚酸（见图3D）。对差异倍数最高的前20种代谢物的分析表明，与FO-L组相比，FO-H显著上调了4-甲基-5-噻唑乙醇、2-苯乙胺、L-酪氨酸甲酯、1-[(2E)-3-(4-甲氧基苯基)-1-氧代-2-丙烯基]吡咯烷和2-呋喃甲酸等差异代谢物的含量，同时显著下调了橙黄胡椒酰胺乙酸酯、水杨醇、二葡糖基杨梅苷、布卢竹柏醇等（见图S4）。这些代谢物并不是茶中的主要风味化合物。乌龙茶“清香”风味的主要成分是醇类、酯类和烯类化合物。在FO-H组中增加的L-酪氨酸甲酯是一种酯类化合物，而4-甲基-5-噻唑乙醇是一种醇类化合物。因此，在重揉捻乌龙茶中，L-酪氨酸甲酯和4-甲基-5-噻唑乙醇可能是提升乌龙茶汤醇厚度和新鲜感度的关键代谢物。然而，这些物质的风味阈值仍然不确定，因此，需要对风味代谢物进行进一步分析，以明确重揉捻如何通过关键差异代谢物改善乌龙茶的品质。

与FO-L组相比，FO-H中的涩味特征成分如茶黄素和2-呋喃甲酸分别增加了1.11倍和1.45倍，但它们对茶汤涩味的贡献较小。茶黄素对红茶的风味有重要贡献，包括茶色、独特口感和香气。2-呋喃甲酸具有独特的甜味和焦糖香气，这影响着茶的整体香气。因此，通过重揉捻提高乌龙茶品质的关键差异代谢物是茶黄素和2-呋喃甲酸。此外，FO-H组还增加了甜味特征成分5-氧化脯氨酸（Log₂FC: 1.21）、苦味特征成分色氨酸（Log₂FC: 1.25）、L-酪氨酸甲酯（Log₂FC: 1.39）、苯酰胺（Log₂FC: 1.53）、L-酪胺（Log₂FC: 1.66）和吡咯-2-羧酸（Log₂FC: 1.70）。然而，这些代谢物在茶中的含量较低，它们不是影响茶味的主要物质。它们间接影响乌龙茶的整体风味。总之，通过重揉捻提高乌龙茶品质的关键代谢物是茶黄素和2-呋喃甲酸，茶黄素和2-呋喃甲酸主要影响乌龙茶的色泽和香气。

在K-均值聚类分析的结果中，亚类1（13种差异代谢物）的相对含量随着揉捻程度的增加呈现下降趋势（见图4A）。相比之下，亚类3（34种差异代谢物）和亚类4（62种差异代谢物）的相对含量随着揉捻程度的增加呈现上升趋势（见图4C和D）。在亚类3和4中，由于重揉捻，12种风味代谢物的相对含量有所增加。这些主要包括苦味代谢物，如三甲胺、L-酪胺、苯酰胺、2',4',6'-三羟基苯乙酮、L-酪氨酸甲酯、吡咯-2-羧酸和色氨酸。由于重揉捻，三种涩味代谢物的相对含量也有所增加，如2-呋喃甲酸、香草酸和茶黄素。此外，甜味代谢物5-氧化脯氨酸和酸味代谢物壬二酸的含量也显著增加。由于上述化合物在茶叶中的含量较低，它们对茶汤的口感直接影响较小，可能通过与其他化合物的相互作用影响茶叶的风味特性。

为了阐明重揉捻工艺对茶叶代谢途径的影响，我们对70种差异代谢物进行了KEGG富集分析（见图S5C）。结合对差异风味代谢物富集的分析，共涉及20条代谢途径。其中，代谢途径、次级代谢物的生物合成、辅因子的生物合成以及D-氨基酸代谢被认为是研究重揉捻工艺导致乌龙茶中代谢物演变机制的潜在目标。D-氨基酸代谢途径中注释代谢物动态变化的聚类热图显示了不同组代谢物的变化模式（见图S5F）。苦味特征代谢物吡咯-2-羧酸和甜味特征代谢物5-氧化脯氨酸主要富集在D-氨基酸代谢途径中。代谢途径主要富集了苦味代谢物（L-酪胺和色氨酸）、甜味代谢物（5-氧化脯氨酸）和涩味代谢物（2-呋喃甲酸）。因此，重揉捻工艺通过改变茶叶的代谢途径和D-氨基酸代谢，从而提高乌龙茶的品质，增加了乌龙茶的丰富度和鲜爽度。

为了明确通过融合BTF技术所利用的关键挥发性代谢物，以提升乌龙茶的口感品质，我们对三组乌龙茶样本进行了挥发性物质的鉴定，共鉴定出909种挥发性代谢物，其中萜烯类（18.39%）、含氮杂环化合物（18.09%）和酯类（17.07%）是乌龙茶中的主要挥发性成分。在乌龙茶中含量丰富的化合物包括苯乙醇、己酸、4-氨基吡啶和苯乙醛。根据OPLS-DA模型的变量重要性投影（VIP ≥ 1）以及单变量统计分析中的差异倍数原则（差异倍数≥2 或 差异倍数 ≤0.5），我们筛选出了637种显著差异代谢物（见图S6）。

我们对差异挥发性代谢物进行的风味组学分析筛选出了注释数量最多的前10种感官风味特征。与对照组相比，融合BTF技术的乌龙茶（FO-L和FO-H）主要显著增加了果香、清香和甜香，其次是木香、花香、草本香、脂肪香、清新、蜡质、坚果和辛辣香气。果香主要由己酸己酯、四氢-6-戊基-2H-吡喃-2-酮和丁酸己酯构成。经过短暂的发酵过程，乌龙茶新增加了2-十一烯醛、(E)-2-己烯-1-醇和2-呋喃丙酸乙酯等代谢物，这些物质增强了乌龙茶的果香。清新风味主要由丁酸己酯、2-甲基丁酸2-甲基己酯、2-甲基丙基吡嗪和β-蒎烯组成。经过短暂的发酵过程，乌龙茶新增了二氢-吡喃、3,6-二氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2-异丙基-5-甲基己-2-烯醛和(E)-2-己烯-1-醇以及香叶酸。这些代谢物是融合BTF技术提升乌龙茶清香的关键挥发性代谢物。甜香主要由脱氢芳樟醇、丁酸己酯和4-甲基苯乙醛组成。经过短暂的发酵过程，乌龙茶新增了2-呋喃基-1-丙酮、乙酸葑酯、香茅醛、4-乙烯基-4-甲基-3-(1-甲基乙烯基)-1-(1-甲基乙基)-(3R-反)-环己烯、丁酸己酯、乙酰乙酸异戊酯和3-甲基-2-丁烯-1-醇醋酸酯。这些物质具有甜味特性，是融合BTF技术提升乌龙茶甜香的关键代谢物。

与FO-L组相比，FO-H组显著增加了乌龙茶的甜香、清香、木香、坚果香、果香、烘烤香、草本香、花香、菠萝香和可可香。FO-H组显著上调了辛酸、3-甲基丁基酯、2-呋喃基乙酮、羟基三甲基苯酚、1,2,4,5-四甲基苯、己酸丙酯、茴香脑、甲苯、甘油和异佛尔酮代谢物的含量。1,2,4,5-四甲基苯和甲苯主要集中于代谢途径中。因此，重揉捻通过提高细胞损伤率，影响了乌龙茶的代谢途径，并增强了乌龙茶的甜香。

在本研究中，我们采用了广泛的靶向代谢组学分析方法，探究了乌龙茶在结合BTF技术处理过程中挥发性和非挥发性代谢物的演变，共检测到1896种非挥发性代谢物和909种挥发性代谢物，筛选出564种差异性挥发性代谢物和637种差异性非挥发性代谢物。BTF技术处理，显著提升了乌龙茶品质的关键代谢物包括樱桃苷、没食子儿茶素、没食子酸甲酯和黑麦草内酯。BTF技术通过改变黄酮类生物合成和次级代谢物生物合成的代谢途径，减少了茶汤的涩味，增加了丰富度。此外，结合BTF技术处理的乌龙茶显著增强了甜味、清新和果香的香气。通过重揉捻处理提升乌龙茶品质的关键代谢物是茶黄素和2-呋喃甲酸，它们主要影响乌龙茶的色泽和香气。此外，重揉捻过程通过提高细胞损伤率，影响了乌龙茶的代谢途径，从而增强了乌龙茶的甜香。本研究的结果为乌龙茶风味的发展提供了新的理论基础，并为结合BTF技术提升乌龙茶品质的关键代谢物提供了新的见解，这可以用于短期发酵乌龙茶过程中的质量控制活动。在后续研究中，我们将进一步探索不同发酵程度对乌龙茶品质的影响，以及对非挥发性和挥发性代谢物转化和形成机制的影响。