医学2区-湖北中医大：血清代谢组学结合网药揭示三七皂苷改善慢性睡眠剥夺所致认知障碍的机制

PNS灌胃15天后进行水迷宫试验。结果表明，所有研究组的大鼠在整个五个训练日和第六个测试日的逃避潜伏期都有所下降。在第5天，PNS给药组的潜伏期明显短于模型组的大鼠（图1B）。此外，在测试第6天，模型组穿越目标区域的时间比空白组少得多，但PNS需要更长的时间（图1C）。在测试当天，与空白组相比，模型组的穿越平台次数急剧减少，而PNS可以增加其数量（图1D）。图1E显示了空间探索试验和导航试验中大鼠的游泳轨迹图。这些发现表明，PNS可以缓解SD大鼠的认知能力下降，而PNS-H（高剂量）组比PNS-L（低剂量）组更有效。

HE染色用于评估大鼠认知行为评估后海马CA1区的神经元损伤。图1F显示了各组大鼠海马和CA1区的H&E染色。结果表明，空白组神经元分布均匀，形态正常，排列紧密。模型组大鼠的神经元出现萎缩、空泡化和缺失，组织松散，轮廓形状改变。模型组神经元的细胞核要么受损，要么缺失。经PNS治疗后，这些病理缺陷明显减轻。

图1 PNS改善了CSD引起的学习记忆能力和海马神经元损伤。（A）实验程序示意图。（B）逃避潜伏期。（C）在象限中度过的时间。（D）穿越平台的次数。（E）导航试验和空间探测试验中大鼠的游泳轨迹。（F）H&E染色。数据以平均值±标准差表示。与对照组相比，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

2. 代谢组学分析结果

药效学试验表明，CSD建模成功，PNS-L和PNS-H组有效治疗CSD诱导的认知障碍。我们使用血清非靶向代谢组学研究了PNS对CSD大鼠的调节作用。如图2A-B所示，与对照组相比，模型组有4110种差异代谢物（2171种上调，1939种下调），与模型组相比，PNS-H组有4033种不同的代谢物（2018种上调，2015种下调）。主成分分析结果（图2C）显示，质控样品分组明显，表明整个分析方法稳定可靠。同时，CON和MOD组显示出强烈的分离趋势，表明两组的血清代谢物存在显著差异。PNS-L和PNS-H组位于CON和MOD组之间，PNS-H与CON组聚集更紧密，表明PNS可能缓解SD引起的代谢异常，并表现出剂量依赖性趋势。基础监督判别分析PLS-DA结果（R2Y=0.982，Q2=0.837）支持PCA分析结果（图2D）。我们在PLS-DA模型上进行了999置换检验，回归线R2和Q2的预期值分别为0.915和-0.171，小于实际模型的预测值，表明模型没有过拟合（图2G）。

图2 多元统计分析的结果。（A）模型组和对照组之间上调和下调代谢物的火山图。（B）PNS-H和模型组之间上调和下调代谢物的火山图。（C）5组的主成分分析（PCA）得分散点图。（D）5组的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）得分散点图。（E）CON和MOD组之间的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得分散点图。（F）MOD组和PNS-H组之间的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得分散点图。（G）5组PLS-DA评分散点图的999置换检验。（H）CON组和MOD组之间PLS-DA评分散点图的999置换检验。（I）MOD组和PNS-H组之间PLS-DA评分散点图的999置换检验。

我们从PNS-H组中挑选了具有优越治疗效果的样本进行额外测试，以寻找相关的生物标志物。OPLS-DA数据（图2E-F）显示，CON和MOD组之间以及MOD和PNS-H组之间的血清谱存在显著差异，R2Y和Q2值大于0.9。对于CON和MOD组，R2Y=0.998，Q2=0.990；对于MOD和PNS-H组，R2Y=0.998，Q2=0.986，表明开发的OPLS-DA模型具有很强的预测能力。对上述OPLS-DA模型进行了999置换检验，CON和MOD组的回归线R2和Q2的预测值分别为0.854和-0.311（图2H），MOD和PNS-H组的预测值为0.870和-0.283（图2I），均低于实际模型的预测值，这表明模型没有过拟合。在本研究中，VIP>1和t检验p值<0.05的代谢物被确定为可能的生物标志物。

MassLynx 4.1软件用于收集上述潜在生物标志物的数据。为了识别潜在的生物标志物，我们将精确的m/z和MS/MS片段与从互联网数据库（HMDB和METLIN）收集的代谢物信息进行了比较。表2包含35种被确定为可能的生物标志物的代谢物，图3描述了峰面积结果。聚类分析热图（图4A）显示了各组血清代谢物的变化，CON和PNS-H组被很好地归为一类，与MOD有很大差异。结果表明，CON组和MOD组代谢物的变化存在显著差异。然而，PNS提高了代谢物水平。与MOD组相比，PNS上调了其中18种，下调了17种。

表2 PNS处理后血清中的差异代谢物

CON（C）、MOD（M）、PNS-H（P）组（每组n=8）。

与MOD组相比的变化趋势：↑和↓分别表示相应的化合物在各组中上调和下调。

与模型相比，***p<0.001。

图3 对照组、模型组和PNS-H组之间差异代谢物的变化趋势。数据以平均值±标准差表示。与对照组相比，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001；与模型相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图4 血清代谢物的热图和代谢途径分析。（A）CON、MOD和PNS-H组血清代谢物的热图。（B）使用MetaboAnalyst 6.0进行代谢途径分析的总结。（a）甘油磷脂代谢。（b）鞘脂代谢。（c）甘油脂质代谢。（d）核黄素代谢。（e）叶酸一碳库。（f）色氨酸代谢。（g）花生四烯酸代谢。（C）代谢物网络。

为了研究PNS对CSD大鼠代谢途径的影响，我们将上述鉴定的血清代谢物引入KEGG和Metaboanalyst 6.0进行代谢途径分析。本研究重点关注路线影响值大于0.2的潜在目标通路（图4B）。因此，叶酸一碳库、核黄素代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、甘油脂质代谢、花生四烯酸代谢和色氨酸代谢被认为与PNS改善CSD诱导的认知功能障碍密切相关。图4C显示了由KEGG数据库构建的代谢途径网络。红色和蓝色代谢物分别反映了PNS影响的水平增加和降低。

3. 网络药理学分析结果

根据之前的研究，PNS由5个成分组成，包括人参皂苷Rb1、三七R1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rd。我们利用CTD和Swiss Target Prediction数据库的数据，确定了受PNS五个成分调控的291个靶点，并构建了一个C-T网络（图5A）。

从Genecards该数据库收集数据(https://www.genecards.org/)，我们鉴定了6360个与睡眠障碍和认知障碍相关的基因。如图5B所示，234个交叉基因与PNS成分有关。

GO分析结果如图5C所示。使用GO分析确定了重要的生物过程，包括激素反应、细胞迁移的正向调节和类固醇激素反应。细胞成分包括膜筏、质膜外侧和细胞质的核周区。分子功能包括蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶结合和类固醇结合。前20个KEGG分析富集结果显示，相关过程涉及癌症、脂质、动脉粥样硬化以及PI3K-Akt信号通路（图5D）。

为了更好地了解PNS影响CSD诱导的认知障碍的各种过程，我们开发了一个“通路-靶点”网络，其中包含前20条通路及其富集的靶点（图5E）。该网络由259个节点组成（5种化学物质、20条通路、234个靶点和1218条边）。PI3K-Akt信号通路表现出最大数量的靶点连接（degree=156），其次是脂质和动脉粥样硬化（degree=121）、癌症通路（degree=76）等。蛋白质相互作用（PPI）网络从String数据库导出，234个共同靶点已输入字符串数据库，有231个节点和5767条边（图5F）。

为了确定网络药理学评估的控制慢性睡眠剥夺所致认知障碍的PNS靶点与发现的代谢物之间的关系，我们进一步检查了代谢物相关靶点。我们使用Cytoscape构建了一个代谢物-反应-酶-基因网络（图6A），总共产生了201个代谢物靶点。接下来，我们将这些代谢产物靶点与网络药理学分析发现的234个靶点进行了匹配，筛选出了五个重要靶点：LPL、GPAM、HSD11B1、HSD11B2和SULT2A1。进一步的研究表明，这些靶点与五种代谢产物有关，包括鞘氨醇、植物鞘氨醇和二氢鞘氨醇，11-脱氢皮质酮和3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮硫酸盐，它们参与鞘脂代谢和类固醇激素的产生（图6B）。

我们使用五个核心靶点（LPL、GPAM、HSD11B1、HSD11B2和SULT2A1）作为大分子受体，五种活性化合物（三七皂苷R1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1）作为配体，使用CB-Dock2进行分子对接。Vina评分是通过使用Vina软件将受体和配体与其各自的口袋特征对接而计算的综合评分。分数越低，两者的结合就越稳定。图8A显示，五种活性成分与五个核心靶点具有良好的结合能力。我们绘制了靶点-活性成分-对接模式（图7）。

图7 绘制靶点-活性成分-对接模式。R1表示三七皂苷R1，Rg1表示人参皂苷Rg1，Rd表示人参皂苷Rd，Re表示人参皂苷Re，Rb1表示人参皂苷Rb1。

qPCR结果显示，CSD降低了LPL和HSD11B2的表达。然而，PNS逆转了CSD诱导的LPL和HSD11B2的降低。此外，CSD可能导致GPAM、SULT2A1和HSD11B1的升高，而PNS可以通过降低上述基因的表达来发挥认知保护作用（图8B-F）。qPCR的引物如表1所示。

表1 用于qPCR的引物序列

睡眠对于维持生理功能至关重要。CSD可导致多种器官损伤，如影响学习和记忆能力，增加心血管疾病、肠道稳态失衡和其他多器官疾病的风险。中药的特点是安全性和疗效高。本研究旨在通过网络分析和血清代谢组学方法评估PNS在CSD诱导的认知障碍中的作用及其潜在原因。

研究表明，睡眠剥夺会导致大脑兴奋性增加和可塑性改变，从而导致认知障碍。与我们的研究结果一致，CSD对大鼠的学习和记忆能力有显著影响，主要是通过增加逃避潜伏期和减少穿越平台时间。Morris水迷宫实验要求小鼠通过收集和处理与空间方向相关的视觉信号来逃离不愉快的水生环境。这项活动需要长期记忆和空间学习能力。在我们的实验中，尽管进行了五天的导航测试，但模型组大鼠仍然无法快速准确地识别平台。然而，与模型组相比，PNS-L和PNS-H组的大鼠表现出显著降低的逃避潜伏期和更大的学习和记忆能力。在空间探索实验中，PNS处理组的大鼠更频繁地穿过平台。相比之下，模型组大鼠继续表现出较差的探索行为，表明PNS处理组大鼠的认知能力得到了保留，PNS-H组的效果优于PNS-L组。与我们的预期一致，CSD在大鼠中产生了行为异常和认知缺陷，PNS部分改善了这些异常，并具有剂量依赖性作用。HE结果显示，PNS改善了CSD大鼠海马CA1区的神经元损伤。上述结果表明，PNS可以改善CSD大鼠的认知障碍。接下来，我们选择PNS-H组进行了机理研究。

此外，血清代谢组学显示，多种脂质代谢参与了CSD引起认知缺陷的调节，如甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、甘油脂质代谢等。近年来，睡眠与脂质代谢的关系逐渐受到临床关注。几项研究表明，睡眠障碍会导致各种代谢物的改变，主要与脂质或脂肪酸产物有关，这与目前的研究结果一致。许多研究发现脂质代谢异常与AD之间存在联系，脂质代谢异常会增加患AD的风险，脂质生物标志物可用于早期AD临床诊断。最近的一项研究表明，AD和轻度认知障碍（MCI）患者的脂质代谢都是异常的。为了进一步研究PNS治疗CSD所致认知障碍的潜在机制，我们使用了网络分析。结果表明，PNS的五个成分通过调节PI3K-Akt通路等起作用，有待进一步验证。我们的研究结果表明，CSD可能导致认知障碍，代谢组学结果表明，模型组的脂质代谢异常，而PNS可以通过调节脂质代谢来改善睡眠剥夺引起的认知障碍。结合网络分析和代谢组学，我们获得了共同的靶点，即LPL、GPAM、HSD11B1、HSD11B2和SULT2A1。随后，我们使用RT-PCR验证了它们的mRNA表达。

此外，血清代谢组学显示，多种脂质代谢参与了CSD引起认知缺陷的调节，如甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、甘油脂质代谢等。近年来，睡眠与脂质代谢的关系逐渐受到临床关注。几项研究表明，睡眠障碍会导致各种代谢物的改变，主要与脂质或脂肪酸产物有关，这与目前的研究结果一致。许多研究发现脂质代谢异常与AD之间存在联系，脂质代谢异常会增加患AD的风险，脂质生物标志物可用于早期AD临床诊断。最近的一项研究表明，AD和轻度认知障碍（MCI）患者的脂质代谢都是异常的。为了进一步研究PNS治疗CSD所致认知障碍的潜在机制，我们使用了网络分析。结果表明，PNS的五个成分通过调节PI3K-Akt通路等起作用，有待进一步验证。我们的研究结果表明，CSD可能导致认知障碍，代谢组学结果表明，模型组的脂质代谢异常，而PNS可以通过调节脂质代谢来改善睡眠剥夺引起的认知障碍。结合网络分析和代谢组学，我们获得了共同的靶点，即LPL、GPAM、HSD11B1、HSD11B2和SULT2A1。随后，我们使用RT-PCR验证了它们的mRNA表达。

LPL是脂质和脂蛋白代谢中的关键酶，既是连接脂蛋白和细胞表面脂蛋白受体的分子连接，促进脂蛋白摄取，又水解富含甘油三酯的脂蛋白，为代谢组织提供游离脂肪酸。研究表明，LPL一方面可以参与神经系统的脂质循环，另一方面也可以作为胆固醇转运蛋白，这是神经元存活和分化的营养因子。此外，LPL可以与Aβ结合，促进Aβ的细胞摄取和降解，调节小胶质细胞的代谢和吞噬作用，抑制AD的发生和发展。GPAM是GPAT基因家族的成员，其基因编辑酶是催化TG和磷脂生物合成的第一步，并且已经表明，GPAM表达会触发脂肪肝和脂肪组织中50%以上甘油三酯的合成。此外，GPAM影响甘油三酯合成第二步中关键酶的mRNA表达，从而能够调节脂质代谢。SULT2A1介导多种类固醇和甾醇的磺化，促进肝细胞脂质合成，在维持类固醇和脂质稳态中起着重要作用。HSD11B1基因编码的11β-羟基类固醇脱氢酶1型和HSD11B2基因编码的11-β-羟基甾体脱氢酶2型是调节体内皮质醇代谢的主要酶。HSD11B1可以通过下丘脑-垂体-肾上腺轴在组织水平特异性调节皮质醇代谢，这对代谢综合征和免疫反应具有重要作用。研究证实，HSD11B1活性增强是代谢综合征的重要病理机制之一；因此，抑制HSD11B1活性已被建议用于治疗糖尿病和向心性肥胖。HSD11B2基因编码2型11β-羟基类固醇脱氢酶，它将皮质醇转化为无活性的可的松。酶活性的变化可以通过改变循环水平或组织中糖皮质激素的可用性来影响葡萄糖稳态。我们的结果表明，CSD降低了LPL和HSD11B2，提高了GPAM、SULT2A1和HSD11B1 mRNA水平，而PNS逆转了上述基因表达。

通过对网络药理学和代谢组学的综合分析，我们发现了两种代谢途径和五种不同的代谢产物，即鞘脂代谢、类固醇激素生物合成、鞘氨醇、二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇，11-脱氢皮质酮和3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮硫酸盐。我们通过代谢组学研究发现，睡眠不足会导致鞘脂代谢异常。多项研究表明，在阿尔兹海默症的早期阶段，鞘脂代谢（包括神经酰胺）存在复杂的失调模式。鞘氨醇、二氢鞘氨醇和植物鞘氨醇是鞘脂代谢途径中的重要分子，在细胞信号传导、分化和凋亡中起着关键作用。鞘氨醇和二氢鞘氨醇的水平和比例需要在生物体内保持平衡状态，其破坏可能导致各种疾病的发展，如神经退行性疾病。鞘氨醇是鞘氨醇-1-磷酸（S1P）的前体。鞘氨醇和S1P作为信号分子，可以通过与特定受体结合来调节细胞内信号通路，是重要的神经保护信号分子，不仅具有抗炎作用，还可以抑制APP的分泌。植物鞘氨醇具有抗氧化和抗炎作用。本研究的结果表明，CSD导致鞘脂代谢异常。一项研究通过代谢组学分析发现，PNS可以通过调节脂质代谢等代谢途径来改善急性血瘀大鼠的血液循环。多项研究发现，PNS可以通过调节鞘脂代谢（如鞘氨醇）来对抗心肌梗死和心肌缺血。研究表明，PNS可以通过调节甘油磷脂代谢来保护肝脏。多项研究表明，三七可以调节异常的脂质代谢，具有显著的抗炎和降脂作用。我们的研究表明，PNS可能通过调节鞘脂代谢来改善CSD诱导的认知障碍。具体来说，PNS通过上调鞘氨醇、二氢鞘氨醇和植物鞘氨醇起作用。睡眠对激素的产生有显著影响。类固醇激素，包括皮质醇、睾酮、雌激素和黄体酮，对睡眠-觉醒周期有重要影响。一些类固醇激素，如睾酮及其代谢产物二氢睾酮，被认为具有神经保护作用，可以减少氧化应激和炎症，从而改善认知障碍并减缓AD的进展。11-脱氢皮质酮是一种内源性皮质类固醇，它可以通过11-β-羟基类固醇脱氢酶1型酶的活性在心肌细胞和成纤维细胞中转化为具有转录活性的糖皮质激素，这种转化过程可能会在肥胖、炎症和精神障碍等疾病中发生改变。性激素，如雌激素和睾酮，被认为可以保护神经系统并减少神经退行性变。一些研究表明，性激素水平降低可能与AD风险增加有关。3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮硫酸盐是孕烯醇酮的前体；孕烯醇酮是一种神经甾体，影响GABA（γ-氨基丁酸）受体的结合；神经甾体与情绪、认知活动的调节及其与衰老相关损伤的下降有关。我们的研究表明，PNS可以通过上调11-脱氢皮质酮和3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮硫酸盐来抑制CSD诱导的认知功能障碍。

三七作为一种在中国广泛食用的民族药物，已被证明能有效治疗血瘀、止血、活血、止痛。本研究表明，CSD可导致认知障碍，PNS可能通过调节鞘脂代谢和类固醇激素生物合成来改善认知功能（图9）。

图9 机制图。CSD导致海马神经元损伤，PNS可以改善这种损伤。此外，PNS通过五个关键靶点（LPL、GPAM、HSD11B1、HSD11B2和SULT2A1）调节鞘脂代谢和类固醇激素生物合成。具体而言，PNS下调了GPAM、HSD11B1和SULT2A1的mRNA表达，上调了LPL和HSD11B2的mRNA表达。此外，PNS均上调了五种差异代谢物，并通过血清代谢组学和网络药理学进行了全面分析。

本研究证实了PNS在改善CSD诱导的学习和记忆能力损伤以及减轻海马神经元损伤方面的作用。在此基础上，代谢组学分析表明，PNS调节CSD大鼠血清中的35种不同代谢产物，主要涉及与脂质代谢相关的多种代谢途径。此外，对血清代谢组学和网络药理学的综合分析表明，PNS主要通过5个关键靶点（LPL、GPAM、HSD11B1、HSD11B2和SULT2A1）调节2条途径（鞘脂代谢和类固醇激素生物合成）。具体来说，PNS上调了五种不同的代谢产物：鞘氨醇、二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇，11-脱氢皮质酮和3β-羟基孕甾-5-烯-20-酮硫酸盐。进一步的分子对接和qPCR验证实验支持PNS对认知功能的改善与血清代谢稳态的调节有关。我们的研究揭示了PNS治疗CSD诱导的认知缺陷的多种途径和靶点，为PNS的新应用和草药研究的新策略提供了支持。