新生儿高胆红素血症又称新生儿黄疸，是新生儿常见的临床问题，该病由于胆红素（主要指间接胆红素（IB））代谢异常，引起血中胆红素水平升高，出现以皮肤、黏膜及巩膜黄染为特征的症状。目前，对新生儿黄疸的治疗主要是通过药物治疗、照射治疗、换血治疗等方法。这些方法对新生儿黄疸有一定的疗效，但对机体有一定的影响。因此有必要探究治疗新生儿黄疸的新方法。
苹果是蔷薇科落叶乔木的果实，作为一种药食两用水果，具有较高的营养价值和经济价值。苹果中含有大量的黄酮类、酚酸类和三萜类等生物活性物质。目前，已从苹果中发现黄酮类35 种。网络药理学是系统生物学的重要组成部分，它可预测中药活性成分和其作用机制，构建“药物-成分-靶点-疾病”的作用网络，为疾病作用机制的研究、新药的研发奠定基础。
河西学院医学院的安琼、魏媛、王贞香*等采用中药复方的网络药理学研究方法，预测苹果活性成分与高胆红素血症的网络关系，探究苹果活性成分的作用靶点与高胆红素血症患者内源性蛋白和信号通路之间的作用关系。并用分子对接验证网络分析的可靠性，然后用制备的苹果醇提取物干预溶血性黄疸大鼠模型，测定总胆红素（TB）、IB等相关指标，探究苹果对溶血致高胆红素血症代谢的作用机制。
1 苹果的活性成分
2 苹果活性成分潜在的靶标
通过Swiss Target Prediction数据库查询17 个化合物的成分靶标，整理获得288 个苹果醇提物的成分靶标。将苹果活性成分的靶标与疾病靶标通过Venny 2.1.0在线软件取交集，获得苹果活性成分治疗溶血性高胆红素血症的潜在靶标81 个，如图1所示。
3 苹果活性成分治疗溶血所致高胆红素血症的关键靶点网络图
4 苹果活性成分潜在靶标KEGG与GO富集结果
5 苹果“疾病-通路-活性成分-靶标”网络图的构建结果
6 分子对接结果
在2.5节构建的网络中，网络中度值筛选排名前5的活性成分（槲皮素、2α-羟基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表儿茶素）分别与网络中较为重要的潜在靶标（AKT1、VEGFA、EGFR、STAT3、SRC）进行分子对接，通过分子对接可以验证上述网络药理分析结果的可靠性。结合能小于-1.2 kcal/mol，表示活性成分和靶标结合良好；结合能大于-4.0 kcal/mol时，表示活性成分和靶标有较强的结合能力。从表2可以看出，苹果筛选的活性成分和获得的治疗溶血所致高胆红素血症潜在靶标有较强的亲和能力，选择这5 种活性成分与潜在靶标分子结合最稳定的对接结果绘制分子对接图（图6）。
7 AE成分分析
8 AE干预溶血所致高胆红素血症大鼠的实验结果
如表4所示，与空白组比较，模型组的血液TNF-α、IL-6质量浓度极显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组、AE高剂量组、AE中剂量组、AE低剂量组的TNF-α、IL-6水平明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。
讨论与结论
有研究表明，苹果多酚可通过清除自由基抑制脂质过氧化反应，提高机体抗氧化能力，促进肝细胞修复与再生，从而起到保肝利胆的作用。通过网络药理学的分析，筛选出17 个符合胃肠吸收度高、类药性优的苹果活性成分。其中槲皮素、2α-羟基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表儿茶素在治疗溶血所致高胆红素血症起重要的作用。研究发现β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、调节免疫系统、抗衰老等生物活性，从而能够发挥抗溶血性黄疸的作用；槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗衰老、提高免疫力、抗肝病等作用，故有助于溶血性黄疸的治疗；表儿茶素具有抗炎、抗氧化、保护神经、预防非酒精性脂肪肝和抗肝纤维化，从而发挥抗溶血性黄疸的作用。
溶血所致高胆红素血症与苹果活性成分的交集靶点有81 个，中度值排名前5的关键靶点为AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3。AKT1参与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol kinase 3，PI3K）、EGFR等多个通路，在炎症、细胞增殖、迁移和纤维形成的肝损伤过程中起着独特的作用。VEGFA的表达可以促进血管形成，在肝脏的再生和修复过程中起重要作用。
GO的富集分析预测苹果的活性成分可能通过与蛋白质结合，激活跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、激酶活性、磷酸转移酶活性，与泛素-类蛋白连接酶结合等方式，参与细胞迁移正向调控、细胞运动的正向调控、血管内皮生长因子受体信号通路、上皮细胞增殖调控、血管生成等生物过程，从而发挥苹果活性成分治疗溶血所致高胆红素血症的作用。
KEGG分析核心靶点通过胆汁分泌、HIF-1信号通路、TNF信号通路、NF-κB信号通路等通路发挥治疗作用；有研究显示，炎症介质既可作为NF-κB信号通路的靶向基因，又可激活NF-κB信号通路，当肝脏损伤时，NF-κB信号通路可参与调控炎症因子的产生主要信号通路。有大量研究表明，NF-κB信号通路可被TNF-α、IL-1β等因子诱导激活，因此可通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-16等炎症因子的表达，下调NF-κB信号通路的相关蛋白改善肝脏损伤。HIF-1的表达受氧浓度的影响，可通过调控下游蛋白，参与细胞增殖、细胞凋亡等生理过程，作为内源性保护机制的始动因子和共同途径。HIF-1与PI3K/Akt信号通路关系密切。有研究表明，右美托咪定可通过激活PI3K/Akt信号通路减少梗阻性黄疸的肝细胞凋亡。
苹果中筛选的活性指标槲皮素、2α-羟基熊果酸、β-谷甾醇、根皮素、表儿茶素分别和中度值排名前5的关键核心靶标（AKT1、VEGFA、EGFR、SRC、STAT3）进行分子对接，大部分对接结果的结合能小于-4.0 kcal/mol，这表明苹果筛选的活性成分和获得的治疗溶血所致高胆红素血症潜在靶标有较强的亲和能力。AE中有槲皮素、表儿茶素、根皮素、β-谷甾醇等活性组分，结合网络药理学的分析结果，这些组分对溶血所致高胆红素血症起重要作用。
盐酸苯肼进入腹腔吸收入血后，能迅速与HB形成高铁血红蛋白并生成海因兹小体；生成的海因兹小体沉积在细胞膜上，使其流动性下降、渗透性增加，并可裂解部分细胞膜功能，导致溶血发生，而盐酸苯肼本身并无明显神经毒性，故能较好地模拟新生儿溶血致高胆红素血症的生理过程。在人体中，胆红素主要经人体的肝脏代谢，代谢的过程中需要多种酶的参与完成。当患高胆红素血症时，体内三磷酸腺苷的活性和心肌细胞对氧的摄取受到抑制，导致大量氧自由基堆积，可造成心肌损伤；ALT和AST是肝细胞受损、心肌受损的标志，因此造模成功后大鼠的HB水平下降，TB、IB、ALT、AST的水平升高；肝组织病理切片显示，模型组出现淤血和点状坏死，其炎症因子TNF-α、IL-6水平增高。用茵栀黄注射液和AE干预后HB水平升高，其他指标下降，肝细胞轻度水肿。网络分析结果与动物实验结果相一致，说明茵栀黄注射液和AE对溶血所致的高胆红素血症有治疗作用。
综上所述，本研究基于网络药理学、分子对接、动物实验探讨了苹果治疗溶血所致高胆红素血症可能的活性成分、疾病靶点及通路、筛选的指标性成分与蛋白的相互作用，AE对溶血所致高胆红素血症有治疗作用，所得结果为进一步的实验、临床研究提供了理论方向。但对于关键蛋白、预测的信号通路还需进一步通过实验验证。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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