酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种兼性厌氧的单细胞真核生物，能够在低pH值、高渗透压、营养胁迫等严苛环境下生长，是果蔬食品中常见的腐败菌之一。香芹酚是一种普遍存在于牛至、百里香等唇形科植物中的天然单萜类苯酚化合物，具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种活性功能。目前，香芹酚已被国家卫生健康委员会和美国食品药品监督管理局等批准用作食品添加剂，广泛应用于圣女果、苹果汁、鲜切苹果等多种食品的防腐保鲜研究中，具有提高易腐食品货架期和安全性的潜力。
郑州轻工业大学食品与生物工程学院的牛力源、孙晓诚和商丘师范学院的张志坚*等以酿酒酵母为对象，研究温度、pH值、果糖等果蔬食品体系中常见的环境因素对香芹酚抑菌效果的影响规律，并采用多种细胞生物学手段，评估酿酒酵母细胞形态、细胞壁膜结构和功能等生理特性的变化，同时利用转录组测序技术研究香芹酚对酿酒酵母细胞转录组的影响，分别从细胞水平和分子水平探索香芹酚胁迫抑制酿酒酵母的作用机制，以期为香芹酚在果蔬产品贮藏保鲜中的应用提供理论参考。
1 香芹酚对酿酒酵母MIC的影响
如图1所示，当香芹酚质量浓度为80 µg/mL时，与未处理组相比，酿酒酵母出现了生长抑制。当香芹酚质量浓度低于40 µg/mL时，未表现出对酵母菌生长的抑制作用。当香芹酚质量浓度为160 µg/mL时，酵母细胞生长完全被抑制，因此，香芹酚的MIC为160 µg/mL。Chavan等也报道了相似的结果，香芹酚对分离自酿酒葡萄果表的天然酿酒酵母的MIC为128 µg/mL，这可能是由于实验方法和使用的菌株不同，导致MIC略有差异。将香芹酚对酿酒酵母的MIC（160 µg/mL）用于后续环境因素对香芹酚抑制酿酒酵母效果的影响研究。
2 环境因素对香芹酚抑制酿酒酵母效果的影响
如图2A所示，随着环境温度的升高，香芹酚的抑菌效果不断增强，在40 ℃时对酿酒酵母菌的抑制作用最强，活菌数减少了2.23（lg（CFU/mL））。较高的温度可能增加细胞膜和线粒体膜的流动性，并且能够提高香芹酚的溶解度，有助于增强酵母菌对香芹酚处理的敏感性。
3 香芹酚对酿酒酵母细胞形态的影响
如图3A所示，未经处理的酿酒酵母细胞表面完整，呈规则的椭圆形或球形，细胞表面没有明显的损伤。经终质量浓度为160 µg/mL的香芹酚在30 ℃条件下处理30 min后，酵母细胞的表面出现不同程度的凹陷（图3B）。百里香酚为香芹酚的同分异构体，区别在于羟基所在酚环上的位置不同。Wang Huxuan等发现62.5 μg/mL百里香酚在28 ℃条件下处理鲁氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）18 h会导致细胞表面出现明显皱缩。这表明细胞壁膜可能是香芹酚、百里香酚等单萜酚类化合物作用于酵母细胞的靶点之一。
4 香芹酚对酿酒酵母细胞质膜通透性和完整性的影响
5 香芹酚对酿酒酵母细胞膜电位的影响
细胞膜电位在pH值稳态、物质转运等生理活动中起重要作用。DiBAC4(3)染料可以进入去极化的细胞，通过测定其荧光强度可以评估细胞膜的去极化程度。图5中左象限细胞亚群代表细胞膜电位正常的酵母细胞，右象限细胞亚群代表细胞膜去极化的酵母细胞。经80、160、320 µg/mL香芹酚处理后DiBAC4(3)阳性细胞数分别比未处理组（41.99%）显著增加了0.44、0.82、1.32 倍。随着香芹酚处理浓度的增加，酿酒酵母细胞膜去极化程度逐渐加重，这可能与香芹酚的酚羟基有关。香芹酚含有的酚羟基可以作为单价阳离子载体，释放H+，结合胞内K+，并将其转运至细胞外，最终使细胞膜电位发生改变，影响细胞正常的生命活动。
6 香芹酚对酿酒酵母线粒体膜电位和胞内ATP含量的影响
7 香芹酚对酿酒酵母细胞内Ca2+含量的影响
8 差异表达基因分析
9 DEGs的GO和KEGG富集分析
10 部分重要基因的差异表达分析
表2为涉及ATP合成代谢（氧化磷酸化）和核糖体功能的差异表达大于2.0 倍（即|log2差异倍数|＞1）的基因信息。香芹酚处理导致酿酒酵母细胞中呼吸链酶复合体中细胞色素c还原酶、细胞色素c氧化酶和ATP合成酶相关编码基因的表达水平显著下调（PAdj＜0.05）。此外，编码线粒体核糖体（mitochondrial ribosome，MR）结构蛋白的相关基因转录水平也明显下调（PAdj＜0.05）。通过real-time PCR对关键基因（ATP20、COX5A、QCR7、RSM19）的表达进行验证，结果如图10所示，real-time PCR结果与转录组测序结果趋势基本一致，表明转录组测序结果具有较高的可信度。
11 香芹酚胁迫抑制酿酒酵母的分子机制
香芹酚胁迫下，酿酒酵母细胞内线粒体呼吸链复合体相关编码基因的表达受到显著抑制，表明电子传递受到抑制。真核细胞中线粒体膜电位的建立依赖于呼吸链中的电子传递。由于线粒体膜电位具有重要的生理功能，包括合成ATP、代谢物的跨膜转运等，因此，当电子传递受到抑制时，为了维持线粒体膜电位，氧化磷酸化过程中ATP合成酶的功能会发生逆转，由催化ATP形成转变为催化ATP分解，同时将质子从线粒体内膜基质侧泵至内、外膜间隙。本研究中香芹酚胁迫下酵母细胞线粒体膜电位下降（图6A），这可能与电子传递受阻有关，这会导致ATP合成减少、消耗增多，与胞内ATP含量降低的结果一致（图6B）。然而，胞内ATP含量过低则会导致细胞坏死。香芹酚胁迫下ATP合成酶的编码基因显著下调，ATP合成酶的减少会降低胞内ATP的消耗。此外，香芹酚胁迫对MR结构蛋白合成的抑制作用也是阻碍呼吸链电子传递的原因之一。香芹酚胁迫下酿酒酵母DEGs显著富集于MR结构蛋白部分，涉及两个亚基合成的多个基因转录水平显著下降（表2），这表明MR蛋白质的生物合成受到抑制。MR蛋白参与MR组装和线粒体翻译，主要参与线粒体呼吸链复合体的生物合成。由此可见，香芹酚胁迫主要通过抑制线粒体呼吸链复合体编码基因的转录和翻译两种方式抑制电子传递，破坏线粒体膜电位，从而扰乱ATP代谢以及依赖线粒体膜电位的细胞活动。此外，作为许多药物的作用靶点，MR功能障碍还会影响线粒体稳态调节、细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等多种生命活动。以上转录组学分析表明，酿酒酵母细胞线粒体电子传递受阻与MR功能障碍可能是香芹酚胁迫酿酒酵母的重要机制。
结论
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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