大豆营养丰富，蛋白质含量高，是人们日常饮食中重要的蛋白质来源。但大豆又是常见的过敏食物之一，目前仍没有可完全治愈大豆过敏的方法，患者最有效的方法是规避摄入大豆过敏原。β-伴大豆球蛋白（BCG）是大豆中的主要过敏原之一。大豆异黄酮是一种植物类雌激素，其中活性成分主要为染料木素（Gen）、大豆苷元（Dai）和黄豆黄素（Gly），具有抗氧化、抗过敏、预防骨质疏松、防癌抗癌等功效。研究显示，大豆异黄酮可以调节Th1/Th2平衡、减少免疫因子合成、加强人体对致敏食物的耐受。近年来，从食物组分干预的角度研究抗过敏作用受到广泛关注。
南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室的邓雯、廖雅茹、杨安树*等以Gen、Dai 2 种活性异黄酮和BCG为研究对象，利用荧光光谱法分析异黄酮与蛋白相互作用机制及其复合物的结构，并利用竞争酶联免疫吸附测定（ELISA）法和免疫印迹评估复合物及其消化产物的致敏性，以期在分子水平为活性大豆异黄酮与BCG相互作用机制提供新的见解，并为其在食物过敏预防和管理中的潜在应用提供新的方向。
1 异黄酮与BCG相互作用
1.1 荧光猝灭机制
通过荧光猝灭光谱分析Gen/Dai与BCG相互作用的猝灭机制。由图1中Stern-Vlomer图可以观察到，随着Gen和Dai添加量的增加，蛋白荧光强度呈线性下降趋势。根据表2中数据，在298 K和314 K条件下加入Gen和Dai后，BCG的Kq均远大于2.0×1010 L/（mol·s）（最大扩散碰撞猝灭常数），说明2 种活性异黄酮与BCG发生的猝灭属于静态猝灭。静态猝灭是多酚类化合物与蛋白结合的常见猝灭方式，在多酚-玉米醇溶蛋白、白藜芦醇-大豆分离蛋白（SPI）以及表没食子儿茶素没食子酸酯-SPI相互作用的研究中均有体现。
根据Scatchard方程可计算得到BCG与Gen/Dai的结合常数（Ka）和结合位点数（n）（表2）。温度升高，2 种活性异黄酮与BCG之间的Ka均增大，并且不同温度的n都接近1，表明BCG与Gen/Dai在空间结构上至少存在1 个结合位点。
生物大分子与小分子之间存在的非共价作用力主要有氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华力，由热力学参数（ΔS、ΔH和ΔG）可以推断蛋白质与小分子之间相互作用力的类型。通过Van’t Hoff方程计算可得到相互作用的热力学参数（表2）。按照Ross等总结的热力学参数与相互作用力之间的规律，表2中ΔH、ΔS均为正值，表明BCG与Gen、Dai的相互作用力中疏水相互作用起主要作用。这可能是因为Gen/Dai含有碳碳双键和苯环等疏水基团，这些基团与BCG中的疏水基团或结构域发生疏水相互作用。类似地，疏水相互作用也是姜黄素与SPI、VB12与大豆7S/11S蛋白结合的主要驱动力。
1.2 同步荧光光谱
同步荧光光谱通过同步扫描λex和λem可以提供生色团分子附近微环境的信息。当波长间隔Δλ为15、60 nm时，同步荧光分别体现出酪氨酸（Tyr）或色氨酸（Trp）残基微环境的变化。由图2可知，蛋白荧光强度随着Gen/Dai的加入逐渐降低，当Δλ为15 nm时，可以观察到Gen仅对BCG中Tyr残基的最大吸收波长向长波方向移动了1 nm，而添加Dai后，最大吸收波长并未出现明显移动；当Δλ为60 nm时，Gen使BCG中Trp特征峰红移14.6 nm，而Dai使其红移4 nm。某些关键氨基酸决定了蛋白质的结构和功能，这些氨基酸微环境的改变会导致蛋白质整体结构发生相应变化，同步荧光光谱的结果表明，蛋白中酪氨酸和色氨酸周围环境的极性增加，BCG与2 种异黄酮发生络合作用，从而使蛋白结构更加松散，使其内部更多的亲水性氨基酸暴露。由于2 种异黄酮结构存在差异，Gen比Dai多1 个酚羟基，且多出的酚羟基在空间位置上更接近羰基，导致Gen的活性更强，因此对BCG氨基酸残基微环境的影响比Dai更明显。
1.3 三维荧光光谱
为进一步了解Gen/Dai对BCG构象的影响，运用三维荧光光谱进行分析，由图3和表3可知，在λex＝295 nm和λex＝282 nm处，BCG的三维荧光光谱显示出2 个峰。根据峰位置分析，峰a（λex＝295 nm）和峰b（λex＝282 nm）是BCG中Tyr或Trp残基的2 个特征峰。随着2 种活性异黄酮的添加，峰a和峰b的峰高都明显降低。相较于Dai，Gen对峰a的影响更为显著，当BCG∶Gen＝1∶10时，峰a完全消失。逐渐添加Gen后，峰b的λem发生红移；而Dai加入后，峰b从原来的282 nm/323 nm红移至284 nm/325 nm和287 nm/325 nm，同时中高剂量异黄酮诱导蛋白产生了一个新的峰c（377 nm/380 nm）。以上信息表明，异黄酮的加入促使BCG的特征峰产生红移，诱导蛋白质结构发生轻微的去折叠或适应性重排，引起氨基酸微环境的极性增加，导致蛋白构象发生变化。
1.4 外源性荧光光谱
1.5 圆二色光谱
α-螺旋结构的圆二色光谱在190 nm附近有一正峰，在222、208 nm波长处有2 个负峰；β-折叠结构在216 nm波长处有一负峰，在185～200 nm波长处有一正峰。由图5可知，当BCG∶Gen＝1∶1时，在蛋白二级结构中，α-螺旋相对含量略有升高，但当Gen浓度继续增加后，α-螺旋和β-转角相对含量明显下降；而β-折叠相对含量随着Gen的添加显著增加。同时Dai的添加使蛋白中β-折叠相对含量显著减少，而β-转角相对含量显著提高。随Dai浓度的升高，蛋白的无规卷曲相对含量则表现出先降低后升高的变化。综上所述，Gen的添加使得BCG的二级结构组成呈现出从α-螺旋、β-转角转化为β-折叠的趋势；Dai的添加使BCG的结构呈现从β-折叠转化为β-转角的趋势，这在矢车菊素-3-O-葡萄糖苷与7S/11S蛋白相互作用研究中也有所体现，使蛋白质结构更为松散。二级结构的变化与前文荧光光谱的研究结果结合，可以看出异黄酮的添加使BCG的结构更为疏松，内部紧凑的基团暴露在外部环境中。
2 异黄酮-BCG复合物结构及潜在致敏性
2.1 复合物的结构
由图6A、B可知，相较于原蛋白，2 种活性异黄酮与蛋白形成复合物的二级结构中α-螺旋相对含量略有升高，占主要地位的β-折叠相对含量均降低。由于结合方式与异黄酮种类不同，2 种复合物结构变化仍有差别，BCG-Gen复合物主要表现为β-转角相对含量显著升高，而BCG-Dai复合物表现为无规卷曲相对含量显著升高。
2.2 复合物的潜在致敏性
通过免疫印迹法鉴定BCG及其复合物消化产物的潜在致敏性。由图7B～E可知，蛋白及复合物消化后存在已被降解的小分子，以及未被消化的蛋白β亚基和大分子聚合物。免疫印迹结果显示，蛋白中β亚基及大分子聚合物显色明显，而消化后小分子不显色。婴幼儿消化产物中BCG-Dai-N与成人消化产物中BCG-Gen-A的免疫印迹条带显色明显强于原蛋白及其他复合物，具有一定的潜在致敏性。消化产物的电泳与免疫印迹结果与前文ELISA结果相互印证，复合物致敏性的升高也可能是由于蛋白质与异黄酮结合后产生了致敏性强的大分子聚合物，导致表现出较强的IgE结合能力。
结论
本研究采用多种光谱方法对大豆中Gen/Dai与BCG的相互作用及复合物的结构进行研究，发现2 种活性异黄酮通过静态猝灭方式猝灭BCG的内源性荧光，n均接近1，作用力以疏水相互作用为主；而2 种异黄酮与BCG相互作用后会导致蛋白的结构与氨基酸残基微环境发生改变，使蛋白结构更为松散。体外血清学实验结果说明，复合物与消化产物的致敏性均强于原蛋白，这可能是由于相互作用后蛋白质结构展开，使更多的过敏原表位暴露。
作者简介
通信作者
杨安树，博士，博导，南昌大学中德联合研究院三级教授，农工党南昌大学一总支副主委，江西省主要学科学术和技术带头人（领军人才）入选者，江西省青年科学家（井冈之星）培养对象，科技部食品过敏创新团队核心成员。任江西省食品科学与技术学会理事，中国研究型医院学会过敏医学专业委员，中国营养学会高级会员和注册营养专家，中国畜产品加工研究会会员等。获江西省科技进步二等奖3项，市科技进步一等、二等奖各1项。作为主要发明人已授权发明专利30余件。在国内外重要学术期刊上发表论文120余篇，其中SC1收录80余篇。主持在研1项国家自然科学基金，1项江西省主要学科学术和技术带头人-领军人才项目；主持完成了国家基金3项、省级课题12项；作为主要骨干参与国家课题和省级课题10多项。指导博士、硕士研究生34人。
第一作者
邓雯，南昌大学食品学院在读研究生，研究方向为大豆过敏。
实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
近期研究热点
《食品科学》：南京农业大学辛志宏教授等：昆仑雪菊标志性黄酮化合物的分离与鉴定
《食品科学》：吉林大学杜志阳副教授等：蛋清肽和姜黄素协同增强多糖基高内相Pickering乳液的界面结构实现活性保护
《食品科学》：辽宁大学薛友林教授等：不同富硒方式对甘薯叶蛋白抗氧化活性的影响
《食品科学》：西北民族大学丁波博士、刘红娜教授等：传统发酵牦牛乳制品中微生物群落及其与代谢产物相关性
《食品科学》：吉林大学张婷教授等：基于静电相互作用的卵白蛋白与岩藻多糖相行为分析及流变学分析
《食品科学》：四川省食品发酵工业研究设计院邓维琴工程师等：红曲霉强化发酵对黄豆酱风味物质及菌群结构的影响
《食品科学》：中国农业大学李媛教授等：食源性活性物质稳态化及靶向递送载体的研究进展
