浙江工业大学食品科学与工程学院周绪霞教授等以草鱼鱼糜为研究对象，比较2 种水解方法对结合丙二醛（bound malondialdehyde，bMDA）中席夫碱的影响，开发了一种先进的MDA检测方法，旨在准确测量鱼糜食品中MDA含量，作为典型水产食品的例子。此外，本研究创建了3 种鱼糜样品（样品A：新鲜鱼糜；样品B：添加MDA的鱼糜；样品C：脱脂添加MDA的鱼糜）比较水解效率，研究了碱性水解过程中脂质氧化对分析结果准确性的影响。最终，气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）定量分析前的后续提取和衍生化进程进一步优化实现了更优MDA定量回收率。
脂肪氧化过程中可在食物中形成各种氧化产物，MDA是多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）脂质过氧化过程中产生的代表性标志物。因此，富含PUFA的食品（如多脂鱼和加工肉制品）可依赖测定MDA含量评估其加工或贮藏过程中的氧化稳定性。硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法是常用测定MDA的分光光度法，以TBA作为衍生剂，使得生物基质中的MDA可以与其反应形成最大吸收波长为532 nm的MDA-TBA复合物。然而，TBA法在检测MDA的特异性方面存在局限性，因为硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）（如基质中的其他醛、糖、氨基酸和天然色素）也可以与TBA发生反应，并表现出相似的吸收波长，可能导致假阳性结果。形成MDA-TBA复合物的衍生化过程多以95～100 ℃、pH值约为4，且TBA法分析高估了实际总MDA（total MDA，tMDA）的含量。目前鉴于更好的分离能力，检测MDA开始应用色谱技术，有 10 多种检测器、数十种色谱检测方法联用了各种肼基衍生剂（2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、全氟苯肼（perfluorophenylhydrazine，PFPH）等）。研究人员优化色谱分析方法，以期提高特定样品中MDA的挥发性和稳定性。与液相色谱相比，GC-MS分析用于MDA定量对分子质量较小的挥发性化合物具有更高的灵敏度，但使用GC-MS法进行衍生物分析在水产品领域的优化研究有所局限。
肉类等食品基质中，游离MDA（free MDA，fMDA）与蛋白质残基（赖氨酸、精氨酸和脯氨酸）可以形成带有亚胺官能团的席夫碱复合物，即使得bMDA成为肉制品中天然存在的主体形式。因此，衍生化过程和GC-MS检测前的水解处理对于分析MDA的准确性至关重要。水解处理能分解肉类蛋白质和MDA之间的共价键，随蛋白质羰基化释放出更多fMDA。目前测定中的水解通常使用5%～10%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，它也可以在水解物中沉淀干扰检测的水溶性蛋白质。临床研究发现，TCA水解后获得的MDA读数远低于NaOH水解的读数。与碱性水解相比，TCA水解下水解效率较低可能与处理时间短、含量低有关。MDA测定中酸水解的另一个潜在结果抑制原因可能与涉及有机氢过氧化物的酸催化反应的Hock重排过程有关，导致水解过程中MDA的形成减少。由于热脂质氧化，伴随着加热效应的碱性水解可能会导致更大的MDA结果。
碱性水解处理下，MDA的检测峰高于TCA水解法，这一趋势呈现在3 种样品模型种，NaOH水解可获得的最大峰面积约为TCA水解法下的2 倍。样品A经TCA水解后，GC-MS中MDA信号的峰面积随TCA质量浓度升高而增大；碱水解条件下，随NaOH浓度的增加，峰面积逐渐增大并趋于稳定。样品B为调控高脂肪氧化水平而制备，2 种水解方法均可见导致MDA含量明显高于其他模型。TCA质量浓度达到15 g/100 mL或NaOH浓度达到0.5 mol/L时，水解效率相对更高。样品C通过亚临界萃取去除脂肪并调控了MDA水平，结果显示碱性水解下随NaOH浓度增加，峰面积逐渐稳定，这与其他模型趋势相似。可见高浓度NaOH对食品基质中MDA席夫碱复合物的水解效率更高。综合3 种样品的水解效率变化规律，可认为碱性水解下不同鱼糜模型的MDA检测更加一致，在1 mol/L NaOH下fMDA的释放量最高。
图3 TCA水解（A）和NaOH水解（B）过程中溶剂浓度对3 种鱼糜样品模型最终MDA定量的影响
为评估2 种水解方法对鱼糜样品氧化水平的不同浓度MDA检测准确度，比较了样品D（新鲜鱼糜中添加1%～10%鱼油）的MDA峰面积。TCA水解法下，含5%和10%鱼油的样品的峰面积明显高于对照样品（0%）。结果表明，无论TCA试剂的质量浓度如何，鱼糜样品中油的存在都会加剧MDA读数的偏差。此外，在相同TCA质量浓度下，检测到的脂质氧化水平与添加的鱼油含量成正比，特别是在15 g/100 mL时，根据之前的实验结果，水解效率最高。对于碱性水解法，高浓度NaOH（1～2 mol/L）水解具有最高的水解效率，所有碱性浓度下添加油脂均不影响样品中脂质的氧化程度。TCA溶液易催化MDA与油脂成分中的反应物质发生反应，因此与碱性水解相比，脂质氧化更为严重。因此，碱性水解下的检测精度优于酸性水解。
图4 TCA水解（A）和NaOH（B）水解过程中添加的鱼油含量对最终MDA定量的影响
由于方法D（HCl-TCA酸沉淀）和方法A（乙腈（acetonitrile，ACN）-正己烷萃取）均达到可接受的蛋白质沉淀，因此进一步评估其在衍生化过程中的方法灵敏度。考虑影响测定灵敏度的因素可能与MDA在ACN中的低溶解度、MDA和PFPH在ACN溶液中的反应亲和力以及最终正己烷中MDA-PFPH衍生物的存在有关。针对衍生化条件进一步单独优化了2 种方法。对于方法A，测试的衍生化因子包括pH值、温度和时间。结果表明，MDA衍生物的最大峰面积出现在pH 2.0、50 ℃和60 min。在第二次萃取过程中，由于用于从ACN中提取MDA衍生物的唯一溶剂是正己烷，因此在萃取溶剂的使用上没有可比性。对于方法B，除MDA衍生物的产量外，提取效率还可能受到原始碱性水解物中的离子强度和二次提取溶剂类型的影响。在pH 3.0、40 ℃和60 min下衍生化时，MDA衍生物的回收率达到最高，无离子强度。考虑到乙酸乙酯和正己烷中存在的MDA-PFPH都能达到最高的回收率且无意义，因此在第二次提取过程中选择正己烷提取MDA-PFPH检测分析灵敏性较高。
图5 不同衍生化过程改良操作下的分相状态
A.方法D（最终检测前的HCl-TCA沉淀和溶剂萃取）控制不同的pH值、温度和时间、应用的NaCl浓度和第二种萃取溶剂；B.方法A（在液-液萃取过程中添加ACN和正己烷），控制不同的pH值、温度和时间。
图6 碱水解后衍生化条件对MDA峰面积增加速率的影响
方法D在回收率上优于方法A法。方法A下的分析回收率为78.4%～94.7%，方法D下为91.2%～102.1%。方法A的日内分析回收率和精密度分别为10.59%和22.12%，而方法D的日内分析回收率和精密度仅为3.12%和4.29%。ACN提取法的回收率和精密度较差可能是由于样品的pH值差异、ACN提取物中水成分分散不均匀，导致难以保证ACN提取物的pH值在pH值调节后保持稳定，从而影响了MDA衍生物的产量。总体而言，与方法D相比，方法A显示出更强的蛋白质沉淀能力，但检测灵敏度、精密度和回收率较差。综合考虑，本研究选择HCl-TCA酸沉淀法作为检测碱性水解物中MDA-PFPH的最佳检测方案。
回收率计算为方法A和方法D下 MDA 峰面积之和，并修改至总 100%。
本研究全面开发了一种先进的GC-MS定量鱼产品中MDA含量的方法，有望在碱性水解处理下更好地释放鱼糜基质中的bMDA，而不会显著加剧脂质氧化。1 mol/L NaOH在60 ℃下水解60 min的鱼糜水解达到最高水解效率，MDA回收率达到15 g/100 mL TCA水解时的2 倍。研究还证实，碱性水解过程中脂质氧化产生的过量MDA量小于高质量浓度TCA下。总体结论表明，无论样品中脂肪含量如何，碱水解都能促进MDA的回收，并有效避免了MDA与其他反应性物质加工氧化反应产生的偏差信号。为了最大程度地提高检测的灵敏度和精密度，研究了最佳提取处理和提取前的酸沉淀，以减少残留在碱性水解产物中的鱼蛋白的污染，确定方法D应用HCl和TCA调节溶液pH 2～3能够沉淀蛋白质并保持准确性。由于fMDA在碱性环境中稳定性较差，因此在GC-MS分析之前，非常有必要在碱性水解后将MDA转化为稳定的MDA衍生物，以获得更好的回收率和灵敏度。将来，由于脂肪酸分布不同，该测定法的应用可以扩展到其他具有不同氧化易感性的肉制品。
Abstract
周绪霞 教授
浙江工业大学食品科学与工程学院
王文洁 副研究员
浙江工业大学食品科学与工程学院
