1 细菌基因组DNA的浓度和纯度检测结果
2 马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种特异性引物设计结果
通过马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种与德氏乳杆菌保加利亚亚种、唾液链球菌嗜热亚种、嗜酸乳杆菌、植物乳植杆菌、发酵黏液乳杆菌、罗伊氏黏液乳杆菌和干酪乳杆菌的16S rDNA序列及其他基因序列对比，找出序列相差较大的片段，通过Primer 5.0软件进行数据分析后得到4 组引物（表3）。
3 特异性引物的初筛结果
4 特异性引物验证结果
特异性引物ZW3-引物-4来自基因WANG_1287，该基因被注释为糖基转移酶（GT）2。GTs介导来自各种糖供体的糖的区域特异性和立体特异性转移到各种重要的生物分子，包括聚糖、脂质、肽和小分子。GT2酶类与蔗糖等二糖、脂多糖、壳聚糖的合成相关，在发酵乳中，这些物质尤其是多糖类化合物可能会影响发酵乳最终的黏度、持水性等特性。而ZW3的特点是高产胞外多糖，且根据王鑫磊等的研究可知，添加ZW3可以增加发酵酸奶的黏度，因此该基因是一个关键特异性基因。
5 real-time PCR的建立
根据普通PCR结果可得ZW3-引物-4具有较强的特异性，因此使用该引物进行real-time PCR验证。将植物乳植杆菌MA2、植物乳植杆菌BC 299、马乳酒样乳杆菌XL 10、马乳酒样乳杆菌1207和马乳酒样乳杆菌ZW3提取的基因组DNA使用该引物在同一条件下同时进行real-time PCR，结果如图3所示，除马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种出现标准的“S”形曲线，且Cq约为17，说明扩增效率高，其余菌株均未出现扩增，说明该引物特异性好，只对马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种有特异性扩增。
将ZW3的DNA质量浓度稀释至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 μg/mL共7 个梯度进行real-time PCR，检测反应体系的灵敏度，扩增曲线如图4所示，0.000 5 μg/mL和0.000 1 μg/mL的扩增曲线与NTC组相重合，并根据表4可知，NTC组的Cq平均值为31.74，为了保证实验数据的可信度，选择Cq≤30时为阳性检出。在质量浓度为0.001 μg/mL时，Cq为29.87，因此本实验方法最低可以检测质量浓度为0.001 μg/mL。
以20、2、0.2、0.02、0.002 μg/mL 5 个马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的DNA质量浓度进行重复性实验，结果见表5，对所得的Cq进行统计学分析。马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的5 个质量浓度样品Cq的SD在0.05～0.23之间，RSD在0.26%～0.95%之间，小于1%，在可接受范围内，因此，建立的real-time PCR检测体系具有较好的重复性。
6 real-time PCR方法的应用
6.1 在马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种其他菌株纯培养物检测中的应用
real-time PCR方法建立后，为了检测方法的实用性，使用本实验室保藏的已知亚种的菌株进行验证。马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW18、LK180和W182是本实验室在中国科学院微生物研究所鉴定的已知亚种的3 种菌株。首先通过DNA提取试剂盒提取这3 株菌的DNA进行质量浓度和纯度的检测，3 株菌的DNA质量浓度均大于200 μg/mL，表明DNA浓度较好，且1.8＜A260nm/A280nm＜2.0，可用于后续特异性PCR和real-time PCR的检测。
在实际应用中，益生菌通常都不是单独使用，而是和其他益生菌共同使用，因此从纯培养物水平和纯基因组DNA水平分别检验所建立的real-time PCR方法的抗干扰能力。纯培养物水平检验结果如表6所示，添加德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种不影响该方法对马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的检测。基因组DNA水平检验结果如表7所示，混合DNA体系中含有德氏乳杆菌保加利亚亚种和唾液链球菌嗜热亚种的DNA不影响马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种的检测，且至少能检出0.02 μg/mL的DNA。
本实验使用含有德氏乳杆菌保加利亚亚种菌粉、唾液链球菌嗜热亚种菌粉和马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3菌粉（3 株菌的添加比例为1∶1∶1）的复合益生菌菌粉混合体系进行验证，以纯马乳酒样乳杆菌马乳酒样亚种ZW3菌粉为对照，两个体系的real-time PCR验证结果如图8所示，两个体系均有明显的扩增曲线，且两个体系的扩增曲线距离较近，Cq差距也较小，表明添加其他菌粉不影响目标菌株的检出，所建立的real-time PCR方法可以特异性地检测该亚种。
结论
实习编辑：申婧婧；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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