Introduction
Results
由图2可知，因此，Se以亚硒酸基团的形式与多糖相链接。
图2 LNT和Se-LNT-3的XPS图谱
由图3可知，硒化取代发生在C6位置。
结果表明，随着超声时间的增加，LNT样品的Mw呈下降趋势（表1）。超声降解和沉淀分级可以有效得到具有不同分子质量的LNT组分。在水溶液中，LNT及其硒化物衍生物所得α值均大于0.7，表明它们在水溶液中呈现出半刚性结构。随着硒化程度的增加，Rh值也在减小，且所有样品的Rg/Rh值均高于2.0，这也表明Se-LNTs仍保持着半刚性结构。随着超声降解程度的增加，LNT链变得更短，导致α值略有增加，即链刚性增强。硒化后，Se-LNT的链刚性略高于具有相似分子质量的dLNT，这表明硒化基团的引入增加了主链的空间位阻，并在一定程度上增强了链刚性。
图4 在不同NaOH浓度下刚果红与LNT或Se-LNT的紫外光谱λmax
LNT及其硒化物的抗肿瘤活性
图5为不同Se-LNT和LNT对HCT116细胞增殖的影响。4 种LNT对HCT116细胞没有抑制作用。添加浓度大于100 μg/mL的Se-LNTs，48 h后，细胞存活率显著降低，并呈剂量依赖性。硒化程度中等的Se-LNT-2对肿瘤细胞显示出最佳的抑制作用。从Se-LNT-2和Se-dLNT-1样品可以看出，在分子质量相同的情况下，增加硒的取代度可以获得更好的抗肿瘤活性。当硒化程度相近时，分子质量较大的Se-LNT-1比Se-dLNT-1显示出更好的抗肿瘤效果。这些结果表明，通过优化反应试剂浓度、温度和时间来提高硒化程度，并不一定会增强抗肿瘤活性，因为这往往会导致多糖分子质量持续下降。
图5 LNTs和Se-LNTs在25～400 µg内对HCT116细胞的细胞毒性
Se-LNT的细胞摄取率及内吞途径
结果可知，对于所有Se-LNTs，摄取量随时间增加而增加，并在不同时间间隔达到平台期（图6A）。Se-LNT-2的摄取速率较快，在1 h时摄取速率最高，并在3 h时达到平台期。Se-LNT-1、Se-dLNT-1和Se-dLNT-2的摄取速率相对较慢，大约需要4 h才能达到平台期。相比之下，Se-LNT-1、Se-LNT-2和Se-dLNT-1在4 h时的摄取浓度较高（分别为18.5、16.2和16.7 μg/106细胞），而Se-LNT-3的摄取浓度为8.8 μg/106细胞。
图6 时间（A）和内吞抑制剂（B）对Se-LNTs细胞摄取的影响
如图7所示，LNT及其超声降解产物dLNT-3对肿瘤细胞凋亡的影响较小。4 种Se-LNTs处理后，观察到凋亡细胞比例显著增加。特别是，Se-LNT-2对HCT116细胞的抑制效果最为显著。经Se-LNT-2处理48 h后，HCT116细胞中正常细胞的比例降至18.0%，而晚期凋亡细胞的比例激增至75.1%。这些发现表明，硒对细胞的细胞毒性作用主要与凋亡通路的激活有关，而非坏死过程。
图7 LNTs和Se-LNTs处理HCT-116细胞48 h后的细胞凋亡率
如图8所示，经过24 h的孵育后，LNT和dLNT-3组的高水平活性氧（ROS）含量保持在10%以下。相反，经Se-LNTs处理后，相对高水平ROS含量显著增加。值得注意的是，Se-LNT-2为66.1%，比LNT组高出8 倍。这一观察结果表明，Se-LNT-2显著诱导HCT116细胞中ROS的产生。
图8 LNTs和Se-LNTs处理HCT116细胞24 h后细胞内ROS水平
LNT组中约有5%的细胞表现出低电位（图9A）。经4 种Se-LNTs处理后，线粒体受损明显增加，其中Se-LNT-2的效果最为显著，低电位细胞比例达到62.8%。与对照组相比，HCT116细胞中Caspase-3的活性显著升高，Se-LNT-2组在24 h时增加了328%（图9B）。综上所述，Se-LNTs刺激ROS的产生，由于HCT116细胞的抗氧化能力较弱，细胞内ROS的积累会导致线粒体损伤，降低线粒体膜电位，激活HCT116细胞中的Caspase-3，最终导致细胞凋亡。
Conclusion
本研究采用硝酸-亚硒酸钠法对LNT及其降解产物dLNT进行修饰，制备了4 种Se-LNTs。结果表明，硒以亚硒酸酯的形式与LNT的C6位置相连。硒化修饰会导致Mw降低和链刚性增加。这4 种Se-LNTs的细胞摄取机制存在显著差异。随着Mw的降低和链刚性的增加，Se-LNT的细胞摄取率降低，摄取方式从巨胞饮转变为网格蛋白介导的CVME。体外抗肿瘤活性实验显示，LNT和dLNT对HCT116细胞的抑制作用可忽略不计。4 种Se-LNTs表现出明显的抑制作用，其中Se-LNT-1和Se-LNT-2因具有较高的摄取率而显示出更高的抑制率。此外，研究发现Se-LNTs能刺激HCT116细胞产生大量ROS，过量ROS积累使HCT116细胞易受线粒体过氧化损伤，导致线粒体内膜通透性增加。最终，激活凋亡蛋白酶Caspase-3，导致HCT116细胞凋亡，从而产生抗肿瘤效果。
许春平，博士，教授，博士生导师，河南省“百人计划”特聘专家，陕西科技大学兼职博导，河南省高校科技创新人才，河南省高校科技团队负责人，行业内烟草工业生物技术重点实验室学术委员会委员，四川省、江西省、安徽省科技奖励评审专家，担任Biotechnology and Bioprocess Engineering（SCI收录）与Journal of Biologically Active Product From Nature编委。现任郑州轻工业大学国家烟草局烟草工业生物技术重点实验室副主任，郑州轻工业大学科协副主席。主要从事生物化工和烟草工程研究。近年来，主持国家自然科学基金面上项目1 项、省厅项目8 项和河南中烟、广西中烟、重庆中烟等企业横向课题10余项，发表论文160余篇，其中SCI收录120余篇，中科院一区12 篇、二区20 篇，高被引论文8 篇，担任Process Biochemistry等国际期刊审稿人。出版学术专著10 部，其中英文图书4 部。获得河南省科技进步二等奖1 项，河南省科技进步三等奖3 项，中国烟草总公司科技进步二等奖1 项，河南省教育厅科技成果一等奖2 项，授权国家发明专利16 件。
Impact of molecular weight and chain rigidity on the endocytosis and anti-tumor activity of seleno-lentinan
Abstract
This study focused on the modification of lentinan (LNT) and its degradation product, dLNT, through the nitric acid-sodium selenite method, resulting in the synthesis of 4 distinct seleno-polysaccharide (Se-LNTs). The selenium moiety was found to be connected to the C6 position of LNT in the form of selenate. The selenization process led to a notable reduction in molecular weight and an augmentation in chain rigidity. As the molecular weight decreased and chain rigidity increased, the cellular uptake of Se-LNT diminished. Additionally, the uptake pathway transitioned from macropinocytosis to caveolin-mediated endocytosis (CVME). In vitro cell experiments showed that all four Se-LNTs showed obvious anti-tumor activity, and Se-LNT-2 had higher selenium content and cellular uptake rate, showing better inhibitory effect. Furthermore, Se-LNTs were observed to induce a substantial production of reactive oxygen species (ROS) in HCT116 cells. The excessive ROS levels triggered mitochondrial peroxidation damage, escalating mitochondrial inner membrane permeability. This cascade event eventually led to the activation of caspase-3, ultimately leading to apoptosis in HCT116 cells and substantiating the anti-tumor effects of Se-LNTs. The comprehensive investigation into the structural modifications, cellular uptake mechanisms and biological activities of Se-LNTs underscores their potential as promising agents for anti-tumor applications.
Reference:
文章翻译由作者团队提供
编辑：龚艺；责任编辑：孙勇
封面图片来源：摄图网
J. Future Foods | 分子质量和链刚性对硒化香菇多糖内吞和抗肿瘤活性的影响
J. Future Foods | 蝉花，一种对硫酸葡聚糖钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠具有保护作用的可食用真菌
J. Future Foods | 基于分子对接和分子动力学模拟的香菇酶解提取物生物活性肽筛选策略
J. Future Foods | 黑木耳浆与魔芋葡甘露聚糖复合体系的流变学和凝胶特性研究
J. Future Foods | 1-甲基环丙烯对北虫草贮藏品质的影响
J. Future Foods | 子囊菌亚门药用真菌在治疗2型糖尿病中的应用
J. Future Foods | 21世纪的食用菌营养保健品：评价与未来展望
J. Future Foods | 桑黄在健康和未来食品领域的研究进展
- 扫码关注我们 -
