这个热点资助数量4年翻了18倍！上海交大团队用它联合单细胞，干湿结合1个月拿下9+Top期刊！

学术 2024-10-01 19:00 上海

点进来的宝子是不是都是对这个四年翻了18倍的热点极度好奇呢？其实这个热点就是近期频频登上各大顶刊的乳酸化修饰！从下图可以看到2020年有7个相关项目被资助，后边一路呈指数上升，短短4年到了126项，火热程度可见一斑。

图片来源：小张聊科研

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题目：SLC4A4是前列腺癌中恩杂鲁胺耐药的新驱动因子

杂志：Cancer letters

影响因子：9.1

发表时间：2024.8

关注公众号，后台发送“123”可以直接获取原文PDF，文献编号：240925

研究背景

雄激素受体信号抑制剂(ARSI) enzalutamide (Enz)在晚期前列腺癌(PCa)治疗中显示出关键疗效。然而，耐药的发展是导致前列腺癌患者死亡的一个重要因素。该研究旨在探索Enz耐药的关键机制。

研究思路

通过分析GEO数据库，确定SLC4A4是Enz抗性的新驱动因素。长期Enz治疗导致SLC4A4上调，进而通过NF-κB/STAT3/SLC4A4轴介导P53的乳酸化，最终导致Enz耐药的发生和PCa的进展。SLC4A4敲低可以克服体内和体外的Enz耐药。

主要结果

数据库筛选显示SLC4A4与PCa的恩杂鲁胺耐药有关

为了全面了解导致PCa对ARSI(尤其是enzalutamide)耐药的潜在机制，作者在三个不同的转录组数据集(GSE44905、GSE104935和GSE148397)中对ARSI敏感和耐药的细胞进行了基因表达比较分析。考虑到ARSI耐药与PCa进展之间的重要性和潜在关联，作者假设在PCa进展和ARSI耐药中存在共同的基因组转移。

为了进一步验证这一假设，将差异基因表达分析的范围扩展到包括临床PCa数据集(GSE70770)。在PCa与良性标本的比较中，确定了前10%的上调基因(566个基因)。总的来说，只有一个候选基因SLC4A4在PCa与良性样本中过表达，并随着ARSI耐药而上调。对TCGA数据进行了分析，发现SLC4A4在PCa样品中高表达。而且再次确认了SLC4A4在GSE70770的PCa样本中高表达并与预后不良相关。

既往研究报道，SLC4A4通过AKT介导的信号通路，在体外和体内促进PCa进展，这可能是晚期PCa进展的潜在驱动因素。因此，作者使用TCGA数据进一步评估了SLC4A4表达水平与PCa样本PI3K-AKT-mTOR通路激活之间的相关性。然而，没有观察到它们之间的强相关性。

此外，作者使用人类蛋白质图谱（HPA）的数据对总共40名诊断为BPH或PCa的患者进行了免疫组织化学(IHC)染色。分析显示，与BPH组织相比，前列腺癌组织中SLC4A4的表达在统计学上显著增加。此外，研究SLC4A4突变在PCa样本中的潜在分子机制。发现SLC4A4在PCa样本中的突变率为0.41%(2/492)，未发现SLC4A4与经典抑癌基因TP53或FOXA1之间互斥的突变模式。

SLC4A4调节Enz在体内和体外的耐药性

在集落形成测试中，PCa细胞中SLC4A4水平的增加导致了对Enz处理的抗性。此外，为了进一步评估SLC4A4在Enz耐药获得中的作用，将SLC4A4过表达后的LNCaP细胞用Enz处理。EdU实验显示SLC4A4过表达可以维持细胞活力并赋予Enz抗性。

为了进一步研究SLC4A4对恩杂鲁胺获得性耐药的影响，作者将SLC4A4稳定过表达的LNCaP细胞皮下植入雄性BALB/c裸鼠体内，促进雄激素依赖性肿瘤生长。与Enz治疗组相比，SLC4A4过表达的肿瘤明显更大。Ki67和cleaved caspase-3 IF分析表明，在Enz存在的情况下，LNCaP异种移植物中SLC4A4的过表达导致细胞增殖更多，凋亡更少。

通过scRNA-seq数据鉴定SLC4A4相关转录模式

在确定SLC4A4在Enz耐药和PCa进展中的致癌性质后，作者开始研究SLC4A4在PCa中促进耐药功能的后续分子机制。为此，利用包含两个LNCaP亲本样本和两个LNCaP EnzR样本的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据进行了基因表达分析。随后，从GSE168668数据集中的四个LNCaP细胞样本中获得基因表达谱。最终识别出7个聚类。

我们发现AR靶基因KLK3、FKBP5和SREBF1在1、4和7簇中高表达，表明LNCaP细胞中AR信号通路普遍激活。此外，为了进一步突出在每个集群中激活的最重要的信号通路，在七个集群中进行了GSVA。

此外，作者还对CellChat为各种分析任务生成的各种可视化输出进行了全面分析。由于先前的研究报道胶原蛋白表达改变与前列腺癌的进展和转移有关，作者选择了一些对细胞簇通信有重要贡献的途径，并探索了包括胶原蛋白途径在内的所有细胞簇的不同作用。

为了进一步在单细胞水平上研究恩杂鲁胺耐药的转录模式，作者分离了4个LNCaP样本的簇，发现这些样本之间的细胞簇存在显著差异。接下来，研究SLC4A4在不同细胞簇中的表达。发现虽然SLC4A4阳性(SLC4A4+)细胞比例在Enz耐药样品RESA和RESB中明显较小，但Enz耐药簇(0和5)的SLC4A4平均表达水平高于亲本簇(1、4和7)，表明Enz耐药簇中的SLC4A4+细胞具有更高的SLC4A4基因表达水平。SLC4A4主要与ARID1A、FOXA1和P53共定位，这些基因先前已被证明是PCa进展的关键驱动因素。这些结果强调SLC4A4参与Enz耐药的发展，并在PCa进展中发挥重要作用。

hdWGCNA鉴定的SLC4A4相关细胞模式及下游通路

为了进一步确定SLC4A4相关的细胞模式和下游信号通路，作者对这些集群进行了hdWGCNA分析。合并模块相似性得到与SLC4A4阴性(SLC4A4)和SLC4A4+相关的四个模块。此外，比较了7个集群之间的模块活性，提取了每个模块的核心基因，并综合比较了这些核心基因之间的联系。

为了鉴定Enz耐药过程中涉及的关键基因，作者尝试鉴定SLC4A4+细胞上调DEGs和hdWGCNA关键模块枢纽基因的共同枢纽基因。两组共鉴定出29个基因。随后，利用metscape对29基因进行基因富集分析。DisGeNET分析表明，枢纽基因与转移性去势抵抗性PCa和雄激素非依赖性PCa之间存在很强的相关性。此外，TRUST分析表明，这些共同枢纽基因极有可能受到转录因子AR、PGR、HIF1A和STAT3的调控。

由于PCa形态和分子亚型的高度异质性，SLC4A4表达的变化可能导致PCa细胞类型的进一步分化和不同的功能作用，从而导致Enz耐药的进展。因此，作者进一步探索了七个集群中大多数PCa异质性标记基因的表达，包括神经内分泌、AR信号、干性、基底、管腔和其他crpc相关标记。研究结果表明，在RESA和RESB样本中，集群0和5最有可能高表达AR信号和腔内标记物，以及CRPC相关标记物，表明SLC4A4相关的Enz耐药仍然作用于腔内样PCa细胞，而不是发生基础或神经内分泌转化。

SLC4A4通过NF-κB/STAT3/P53信号改变Enz耐药

考虑到表观遗传变化对Enz相关PCa进展的深远影响，耐药基因鉴定一直是Enz耐药患者的主要挑战。先前的研究报道了不同的染色质可及性是Enz治疗反应中不同转录的基础，并可能增强PCa的耐药性。作者之前的研究使用了ATAC-seq来检测Enz抗性PCa细胞的染色质可及性变化。在Enz存在的情况下，RefSeq转录起始位点(TSSs)的增加表明，Enz处理上调了LNCaP EnzR细胞中SLC4A4基因的染色质可及性，表明SLC4A4参与了对Enz处理的反应。此外，H3K4me1、H3K4me3、H3K27ac和STAT3的ChIP-seq峰分别代表SLC4A4启动子区域内存在表观遗传修饰的结合位点。根据TRUST的结果，SLC4A4也可以受到TF STAT3的调控。因此，为了进一步确定STAT3是否参与调节SLC4A4的表达，作者假设转录因子STAT3在Enz耐药的发展过程中促进了SLC4A4的转录。为了验证这一假设，在JASPAR中搜索SLC4A4启动子中可能存在的STAT3结合位点。序列分析显示了一个潜在候选基因。ChIP实验表明STAT3在PCa细胞系中普遍参与调节SLC4A4的表达。接下来，使用ChIP-qPCR检测了STAT3在SLC4A4基因启动子上对Enz处理的反应。结果表明，与WT细胞相比，EnzR细胞中STAT3与SLC4A4基因的结合有效增加。因此，初步证实了STAT3在PCa细胞中对SLC4A4启动子的转录调控。此外，先前的研究表明，NF-KB/IL-6/STAT3信号的激活可以使Enz负荷下的PCa细胞存活并导致恶性进展。因此，推测SLC4A4上调可能通过NF-xB信号激活来调节Enz抗性。结果显示，Enz处理后LNCaP细胞中SLC4A4和NF-xB/IL6/STAT3信号的表达均上调。

先前的研究报道，SLC4A4在PDAC癌细胞中的抑制作用减轻了TME的酸中毒，这是由于细胞外空间的碳酸氢盐积累和糖酵解减少导致癌细胞乳酸生成的减少。此外，最近的研究表明，肿瘤细胞代谢改变可使P53乳酸化，并参与肿瘤发生。因此，作者随后使用scRNA-seq数据来评估SLC4A4t细胞中的糖酵解途径。随后的分析进一步证明了Enz负荷下EnzR细胞糖酵解过程的上调，并且可以通过敲低SLC4A4进行修正。此外，STAT3敲低和SLC4A4敲低均表现出更高水平的P53靶基因P21和PUMA，表明SLC4A4功能可能调控P53。为了进一步证实这一点，作者检测了LNCaP细胞中的P53乳酸化。结果显示，Enz负荷下的EnzR细胞发生了显著的P53乳酸化，而SLC4A4的敲除恢复了这一作用。

文章亮点

•耐药是导致前列腺癌死亡的关键因素之一。

•GEO数据库分析确定SLC4A4是导致前列腺癌耐药性的主要因素。

•Enz治疗通过NF-κB/STAT3/SLC4A4轴激活SLC4A4并介导P53的乳酸化，随后产生耐药。

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