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1.本研究最大的创新之处就是整合了来自54个样本的216,963个细胞，通过大量的数据，全面分析了乳腺癌淋巴结前转移瘤内异质性和肿瘤微环境重塑的单细胞景观，这是文章质量的关键，文章数据量够大，内容够“结实”。
2.本文紧密结合临床，以乳腺癌淋巴结前转移为主要研究对象，吸引审稿人眼球。并且本文基于公开数据集全面表征了转移上皮细胞亚型以及原发肿瘤和淋巴结前转移之间的TME重塑，简直是纯生信的模板，小伙伴们还不赶快学起来！
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题目：乳腺癌淋巴结前转移瘤内异质性和肿瘤微环境重塑的单细胞景观
杂志：Journal of Translational Medicine
影响因子：IF=6.1
发表时间：2024年8月
研究背景
乳腺癌转移在疾病进展中起着重要作用，是乳腺癌患者死亡的主要原因。转移过程复杂，涉及遗传改变、生物过程以及与肿瘤微环境中细胞的相互作用。然而，乳腺癌淋巴结前转移的分子机制尚不清楚。因此，了解乳腺癌转移的异质性并获得预防其发生和发展的新见解是至关重要的。
研究思路
本研究整合了来自54个样本的216,963个细胞，跨越6个单细胞数据集，全面表征了转移上皮细胞亚型以及原发肿瘤和淋巴结前转移之间的TME重塑。
主要结果
1.原发肿瘤和淋巴结前转移之间的细胞组成异质性
为了研究乳腺癌转移和非转移的细胞多样性，本研究整合了来自6个单细胞数据集的17个原发肿瘤样本和37个淋巴结前转移样本的数据(图1a)。经过质量控制和批次效应去除，研究从原发肿瘤中获得了68,619个细胞，从结前转移中获得了148,344个细胞(图1b)。接下来，使用标准标记基因，研究将216,963个细胞分类为七种不同的细胞类型:上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和浆细胞(图1c)。原发肿瘤和淋巴结前转移的上皮细胞和巨噬细胞的细胞比例相当(图1d)。然而，与原发肿瘤相比，本研究观察到淋巴结前转移中T细胞的积累和成纤维细胞的消耗(图1d)。
图1 乳腺癌原发肿瘤和结前转移的单细胞转录组学分析
2.整合表型相关的大量数据揭示转移性上皮细胞亚型
接下来研究关注上皮细胞，本研究对67,784个上皮细胞进行了重新聚类，其中包括来自原发肿瘤的21,641个细胞和来自淋巴结前转移的46,143个细胞(图2a)。通过Scissor整合大量数据的转移表型后，4961个细胞被鉴定为Scissor +细胞，3484个细胞被分类为Scissor-细胞(图2b)。根据Scissor的结果，本研究将上皮细胞分为8个亚型(图2c)。Epi1-3亚型占转移亚型的大多数，其转移特征是PSMA7、CRIP1、S100A8和S100A9等基因高表达(图2d)。GO分析表明，Epi1-3亚型特异性上调的基因在氧化磷酸化、质子动力驱动的ATP合成和有氧呼吸中显著富集(图2e)。
图2 上皮细胞重聚类分析
3. 上皮细胞亚型单细胞拷贝数变异分析及轨迹分析
上皮细胞亚型之间转录组异质性的存在促使本研究分析它们的基因组变异。拷贝数变异(CNV)分析显示，转移性Epi1-3亚型表现出高水平的拷贝数扩增(图3a)。值得注意的是，研究发现与Epi4-6亚型相比，Epi1-3和Epi7-8亚型均表现出更高的CNV评分(图3b)。此外，克隆分析结果揭示了原发肿瘤和淋巴结前转移之间不同的克隆进化模式(图3c)。为了了解上皮细胞的动态，本研究构建了细胞轨迹来推断原发肿瘤和淋巴结前转移之间的分化关系。在八种上皮细胞亚型中，研究观察到三种不同的状态(图3d)。Epi1-3亚型主要分布在状态1，而Epi7亚型主要分布在状态3(图3e)。随后，根据上皮-间质转化(EMT)评分和CytoTRACE评分对轨迹进行标记，状态3被认为是潜在的根源，因为它的EMT评分低，CytoTRACE评分高(图3f, g)。值得注意的是，转移性Epi1-3亚型以高CytoTRACE评分主导轨迹的末端，表明上皮细胞在转移过程中有精心安排的分化(图3g)。通过分支表达分析模型(BEAM)分析，本研究确定了37个分支依赖基因，这些基因可以调节细胞从分支前(状态3)到细胞命运2(状态1)和细胞命运1(状态2)的分化过程(图3h)。重要的是，研究观察到KCNK15和MUCL1的表达在推断的从分支前到细胞命运2的拟时间内升高(图3i, j)。
图 3 上皮细胞亚型单细胞拷贝数变异分析及轨迹分析
4. 转移上皮细胞亚型的转录调控分析
转移性上皮细胞亚型表现出广泛的转录组异质性，这促使本研究分析这些亚型的调控活性。通过计算调节特异性评分(RSS)，本研究观察到ASCL1在Epi1亚型中表现出最高的RSS，而RARB和NR2F1分别在Epi2和Epi3亚型中特异性富集(图4a)。基于SCENIC结果，本研究进一步构建了一个转录调控网络来探索Epi1-3亚型的潜在转移机制(图4b)。接下来，本研究试图确定每种上皮细胞亚型的特定模块。通过相关分析，将357个调控子聚类为8个主要模块(图4c)。为了研究不同上皮细胞亚型的转移潜力，本研究分析了来自37例淋巴结前转移的25对转移淋巴结样本。通过整合上述8种上皮细胞亚型，本研究观察到来自转移淋巴结样本的上皮细胞与Epi1-3亚型紧密聚集(图4d)。SCENIC结果的相关性分析还显示，转移性淋巴结样本的上皮细胞与Epi1亚型的相关性最强(图4e)。根据Epi1-3亚型的DEGs，本研究发现在两个乳腺癌骨转移样本中，Epi1亚型的得分明显高于Epi2-3亚型(图4f)。相比之下，在一个乳腺癌脑转移样本中，Epi3亚型的得分明显高于Epi1-2亚型(图4g)。
图 4 转移上皮细胞亚型的转录调控分析
5. 淋巴结前转移中肿瘤微环境的重塑
肿瘤转移与TME的支持密切相关。单细胞分析揭示了在淋巴结前转移中成纤维细胞的消耗和T细胞的积累(图1d)。无监督的T细胞聚类显示出17个簇，包括8个naïve T细胞簇，4个自然杀伤(NK)细胞簇，2个CD4+ T细胞簇和3个CD8+ T细胞簇(图5a, b)。具体而言，NK细胞和CD8+ T细胞在淋巴结前转移中显著富集(NK细胞:P = 0.011, CD8+ T细胞（图5c)。虽然细胞比例没有明显变化，但CD4+ T细胞在淋巴结前转移中表现出明显的效应标志物下调和衰竭标志物上调(图5d)。接下来，成纤维细胞亚聚类显示17个簇(图5e)。根据cord等人提出的成纤维细胞分类，这些簇被分为三种癌症相关成纤维细胞(CAF)亚型:基质型CAFs (mCAFs)、炎症型CAFs (iCAFs)和血管型CAFs (vCAFs)(图5f)。值得注意的是，与原发肿瘤相比，结前转移瘤中vCAFs的比例相对较高(图5g)，这意味着vCAFs在乳腺癌转移中的重要作用。
图5 淋巴结前转移中肿瘤微环境的重塑
6. 在结前转移中，vCAF通过CXCL9+巨噬细胞促进毛细血管形成
为了破译TME中细胞组分之间的串扰，本研究分别在原发性肿瘤和淋巴结前转移中使用潜在的受体-配体对构建了细胞相互作用网络(图6a, b)。研究观察到，不同细胞组分之间的串扰在淋巴结前转移中远低于原发性肿瘤。特别是，无论何种亚型，纤维母细胞和内皮细胞之间的串扰在原发肿瘤中占主导地位，而在结前转移中明显减少(图6a, b)。研究发现，与原发肿瘤相比，结前转移中的CXCL9+巨噬细胞通过RARRES2-CMKLR1和ANXA1-FPR1受到成纤维细胞的更多调节，无论其亚型如何(图6c)。随后，本研究发现结前转移中的CXCL9+巨噬细胞通过多种受体配体对，如VEGF-VEGFR1、VEGF -VEGFR 2和CXCL8-ACKR1，进一步调节内皮细胞，尤其是毛细血管内皮细胞(图6d)。
图6 乳腺癌微环境中的细胞相互作用
7. 转移性上皮细胞亚型与不良临床特征相关
接下来，本研究探讨了Epi1-3亚型的临床意义。在TCGA数据集中，富集分数高的组与总生存期(OS)差显著相关(图7a)。此外，在三个独立的乳腺癌数据集中，Kaplan-Meier生存曲线也显示高评分组的OS受损(图7b, c, d)。在乳腺癌的频繁突变基因(> 5%)中，本研究观察到在TCGA和METABRIC数据集中，高评分组的TP53突变频率显著更高(图7e, f)。在METABRIC数据集的临床信息中，高分组也表现出不利的临床特征，包括PR阴性状态的频率明显更高，组织学分级更高(图7g)。在单细胞免疫治疗数据中，本研究提取上皮细胞进行进一步分析。对于仅接受抗pd1治疗的患者，研究发现Epi2亚型的Epi评分最低，而Epi1和Epi3亚型的Epi评分相对较高(图7h)。在接受新辅助化疗后抗pd1治疗的患者中，本研究还观察到Epi2亚型Epi评分最低，Epi3亚型Epi评分降低(图7i)。
图7 转移上皮细胞亚型的临床意义
文章小结
看完这篇文章，有没有觉得文章思路超新颖？本研究以乳腺癌淋巴结前转移为主要研究对象，紧密联系临床，是审稿人想要的方向呦！其次，本研究整合了大量的公开scRNA-seq数据，进行了单细胞数据分析，全面表征腺癌转移的细胞景观，大量数据集的使用，是本文质量的关键，瞬间文章质量上了个档次！文章轻松拿到6分+！想发文章的小伙伴们，赶快抓住单细胞数据分析+肿瘤转移的套路，赶紧大显身手! 关注小云，无论是生信分析还是基础实验，各种创新性思路设计，小云都可以帮你解忧哦~
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