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生信分析结果用qPCR或WB验证不出来,我该怎么办?
学术
2024-10-16 10:03
上海
前段时间,小云为大家分享了遇到审稿人要求补充验证实验的情况该如何处理:
纯生信修回,审稿人要求补充验证实验,我该怎么办?
(点击查看)
文章发出来以后,就有不少小伙伴私信小云,实验补是补过了,但是结果不理想,
要么验证出来差异性不显著,要么表达结果相反,
相信这种情况,进行过生信结果验证的宝子肯定遇到过。那么,遇到这种情况该怎么办呢?
首先咱们分析一下为什么会出现这种验证失败的情况呢?
生信是一种高通量RNA-seq,相当于一个未经过验证的批量实验,相对qPCR或者Western Blot一次只能检测一些基因或者蛋白的表达量而言,生信的准确度确实不如qPCR或者WB的。这是生信本身高通量的性质决定的,无法避免。如果抛开这个问题,
哪些可能的原因会导致验证结果不一致呢?
1. 样本不一致
实验中最常检测的样本主要
细胞、组织和体液
。而且,血液样本又可以分为血浆、血清、全血等,组织又可分为新鲜组织、石蜡组织等。
选择不同的样本很可能会导致验证失败
。
甚至有时选择的样本类型是一致的,但是由于
疾病的异质性
比较高,样本数量差距比较大(比如高通量测序时只选择几个样本而验证时样本量上百个)也会导致验证失败。
通常情况下,
细胞的均一性最好,组织次之,血液最差。
2. 物种不一致
这种情况也很好理解,因为
分子在物种间的保守性是有差异的
,所以在不同物种间(比如人和小鼠)进行验证时出现验证不出结果的情况。
3. 分子不一致
这种情况可能有的小伙伴不是很清楚。一个基因可能会存在多条转录本,当验证的基因有多条转录本时,在设计引物验证时要注意,检测的是后基因还是某条转录本。
4. 平台不一致
RNA-seq几乎覆盖基因的外显子区域,获得的基因表达量实际上综合了该基因所有外显子区域的表达水平,而qPCR是局部区域设计引物并扩增,并不会考虑到基因全长。
ps:目前像孟德尔随机、NHANES、CHARLS、GBD数据库等方向的文章仍然是不需要验证实验的,不想遇到补实验难题的宝子可以考虑这些方向哦,小云可以帮你0实验发文~
验证结果不一致的可能原因不仅仅是以上几点,那么我们该如何挑选基因能避免出现验证失败的情况呢?
1. 选择差异倍数比较大的基因验证
2. 选择满足多重筛选指标的基因
比如表达水平、生存分析、机器学习、WGCNA等均能满足筛选指标的基因进行验证。
3. 多验证几个基因从中挑选符合预期的基因
最后,如果你实在不知道该如何挑选基因也可以联系小云,小云可以在帮你完成分析的同时为你筛选好验证基因。
如果你有申请课题的需求,需要设计更复杂的验证实验,小云也能帮你一站式解决,你有好眼光,我有好品质!
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