Nature Methods：用于长期活细胞单蛋白成像的超光稳定有机染料
大家好，今天给大家分享的是Nature Methods上的文章“Super-photostable organic dye for long-term live-cell single-protein imaging”
【摘要】
有机染料由于其光稳定性和高亮度等优点，在活细胞成像中起着至关重要的作用。 在这里，我们介绍了一种超光稳定且明亮的有机染料 Phoenix Fluor 555 (PF555)，它的光漂白寿命比传统有机染料长一个数量级，且无需任何抗光漂白添加剂。 PF555 是一种不对称菁结构，其中一方面，传统菁-3 中的吲哚被 3-氧代喹啉取代。 PF555 为长期活细胞单分子成像提供了强有力的工具，如在生理条件下对表皮生长因子受体与活细胞质膜上网格蛋白包被结构的动态单分子相互作用进行成像所证明的那样。
【背景】
单个蛋白质通过在不同时间尺度上与其他细胞成分相互作用来实现其分子功能。荧光活细胞成像已成为研究参与动态分子过程的蛋白质不可或缺的工具。特别是单粒子跟踪（SPT）直接可视化工作中的蛋白质分子，提供单分子水平上有关它们动态相互作用的定量时空信息，而这些信息是使用传统集合方法无法获得的。然而，由于荧光染料的光漂白和需要与活细胞兼容的成像条件，活细胞单分子成像的适用性主要限于短期时间尺度（几十秒以下）。这些限制往往意味着SPT仅限于分析快速的分子事件，例如弱的蛋白质-蛋白质相互作用或瞬时固定，而不能探索活细胞中长期发生的以前未见过的分子事件。
尽管纳米粒子（包括量子点和上转换纳米粒子）已被用于长期单分子成像，但由于这些粒子的非特异性、多价性和体积庞大，仍被谨慎使用，因为它们可能会在长期活细胞成像中在完整蛋白质动力学和功能的可视化中引起伪影。
有机染料因其有益的特性而被广泛用于活细胞成像，包括高亮度和光稳定性、小尺寸、多功能性和蛋白质标记特异性。有机染料的光稳定性可以通过涉及葡萄糖氧化酶/过氧化氢酶、吡喃糖氧化酶/过氧化氢酶或原儿茶酸/原儿茶酸-3,4-双加氧酶 (PCA/PCD)的氧清除系统大大提高，这些系统已成为需要强激光照射的单分子和超分辨率成像必不可少的成像缓冲液成分。研究表明，在成像缓冲液中使用 2% 的氧气和还原与氧化系统，可有效抑制 SeTau-647 染料的光漂白，从而使 SPT 的时间延长至数分钟。此外，一种将多种 Atto647N 染料连接到 DNA 支架上的 6 nm 元荧光团，在氧清除系统的作用下实现了长达数分钟的体外单分子成像。不对称振子结构还通过增强激发时不同能级之间的电子跃迁，显著提高了染料的光稳定性，如 Cy3、罗丹明 B 和 Si-pyronine。荧光团的开发进展为长期观测单分子事件提供了新的可能性，但对与活细胞不兼容的添加剂和支架的要求仍然是活细胞成像的一个基本障碍。
在这里，我们鉴定出了一种超光稳定的光蓝化菁染料，即 Phoenix Fluor 555 (PF555)。我们通过大规模光蓝化四磺酸盐 Cy5 (TSCy5) 纯化了 PF555，并表征了其光物理性质。与之前已知的光稳定染料相比，PF555 在活细胞成像中表现出了长一个数量级的光漂白寿命，且无需抗光漂白添加剂。使用 PF555，我们在生理条件下可视化了活细胞中表皮生长因子受体 (EGFR) 在 1 小时内的内化和循环过程，而没有明显的光漂白。此外，我们还可视化了活细胞中 EGFR 与质膜上网格蛋白包被结构的长期单分子相互作用，并捕获了之前未知的 EGFR 内吞分子事件。PF555 为在生理条件下在体细胞和单分子水平上进行长期活细胞成像提供了强大的工具。
图5 | 单分子EGFR和CCS在COS7细胞质膜上的动态相互作用。
【结论】
通过利用光激活和/或光切换荧光团，包括具有氧清除系统和一级硫醇的 mEos 蛋白或 AF647，可以保持明亮状态下标记分子的低密度，从而能够在同一个活细胞中多轮采集单分子数据。收集的大量单分子数据足以进行统计分析，以推断各种扩散状态的转变，包括自由、受限和固定状态。然而，轨迹的持续时间不足以进行长期时间尺度上的分子过程。使用具有自发恢复特性的 PF555 获得的 EGFR 轨迹的高密度图使 EGFR 的扫描状态得以观察，而这在传统染料产生的短轨迹中是不可能的。与传统的全内反射荧光显微镜相比，将 MINIFLUX 等光子高效技术与 PF555 相结合，将显著提高在较长时间内观察更快单分子动力学的能力 。使用 PF555，可以在生理条件下在单个活细胞中直接可视化单个蛋白质与其他细胞成分在各种分子过程中的动态相互作用。
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原文DOI：https://doi.org/10.1038/s41592-024-02584-0
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