高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）是一种高度恶性的妇科肿瘤，通常在晚期被诊断，预后较差。现有的免疫治疗选择有限，解析三级淋巴样结构（TLS）的活性及其与肿瘤微环境的关系，有助于开发新疗法并改善患者生存率。
现有研究技术的局限导致没有详细比较HGSOC中不同解剖位置（如输卵管、卵巢和腹膜）的TLS活性，并且对肿瘤微环境的影响缺乏深入探讨。此外，尽管空间转录组学技术已逐渐普及，其在HGSOC研究中的应用依然有限。
本研究旨在通过来自NanoString的空间转录组学技术平台GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) ，系统分析HGSOC不同解剖部位的TLS活性，揭示肿瘤微环境（尤其是基质细胞）对TLS功能的影响。
内容提要
通过空间转录组发现HGSOC不同解剖部位的TLS在大小、成熟度、数量以及B细胞的活性特征等方面上均具有显著差异，并且观察到患者预后相关的TLS特征，另外还发现癌症教育的间充质干细胞（CA-MSC）会钝化B细胞的功能从而影响TLS的产生。
研究方法
研究样本：
TCGA数据中的未经治疗的495例HGSOC队列
匹兹堡大学104例HGSOC队列
研究方法：生物信息学挖掘、流式分选、IHC、mIF和DSP
技术路线：如下图1展示
图1. 技术路线
细胞分割策略
形态学marker：CD20，CD45，Panck和Syto13
图2. 形态学marker
分割策略：
免疫细胞富集区（CD45+CD20-Panck-Syto13-）
B细胞富集区（CD20+CD45-Panck-Syto13-）
肿瘤细胞富集区（Panck+CD45-CD20-Syto13-）
基质细胞富集区（Panck-CD45-CD20-Syto13+）
图3. 分割策略
研究结果
三种不同解剖部位的TLS空间转录组特征、不同成熟程度TLS的空间转录组特征以及远离TLS的基质区域和邻近TLS的基质区域空间转录组特征
1. 三种不同解剖部位的TLS空间转录组特征
比较了同一患者OV中TLS和肿瘤+基质（no TLS），表征了TLS；
构建了20基因的TLS-DSP的 signature ；
TLS-DSP评分在TCGA队列中应用，结果表明评分高的患者总生存期更高，说明TLS-DSP评分具有预后价值，另外年轻患者中该评分体系获益更明显（图4）；
图4. TLS-DSP评分与患者总生存期的关系
12-CK（TCGA数据库已经验证可用于评估TLS）和TLS-DSP两种评分体系相关性很强，并且两者均与生存具有相似的关系；
使用DSP技术，比较OV、FT和OM三种不同部位肿瘤淋巴结构，证实OM和FT中的TLS比OV中的TLS更具有免疫活性。OM中的TLS上调的基因主要是支持TLS形成的，FT中的TLS上调的基因主要是B细胞激活的（图5）
图5. OM和FT相对于OV表达上调的基因
2. 不同成熟程度TLS的空间转录组特征
不同成熟度TLS定义：不成熟的TLS（20-300个细胞核）、中等成熟的TLS（300-500个细胞核）和成熟TLS（超过500个细胞核）（图6）。
图6. 不同成熟程度的TLS
不同成熟程度的TLS转录图谱有差异；
用CD20+CD45-Panck-Syto13-分割策略，成熟TLS中的B细胞和未成熟TLS的B细胞的转录图谱也有差异，成熟TLS中的B细胞上调的基因主要是是增殖（SLBP）、免疫检查点(CTLA4和CD80)和同型转换(BCL6)等（图7）；
用CD45+CD20-Panck-Syto13-分割策略，成熟TLS中其他免疫细胞富集更多转录调控(BATF)、趋化因子(CCL1)、T细胞激活/耗竭(PD1)、自噬(MAP1LC3A)和树突细胞标志物（DCSTAMP）以及淋巴细胞激活相关的基因(LAT)等（图7）
图7. 成熟TLS中相较于不成熟TLS中的B细胞和免疫细胞的差异基因
用CD45-CD20-Panck-Syto13+分割策略，成熟TLS基质细胞中上调的差异性表达的基因可能参与TLS的形成，包括T细胞受体（PTCRA）、凋亡调控（HRK和BIN1）和表观调控（GATA2和EP300）的通路基因。
3. 远离TLS的基质区域和邻近TLS的基质区域空间转录组特征
远离TLS的基质区域（TLS-Dist）和邻近TLS的基质区域（TLS-adj）空间转录图谱有显著差异，TLS-adj中LTB上调，而间充质和基质沉淀的标志物（波形蛋白、COL6A1和COL6A1）在TLS-Dist富集（图8）；
图8. TLS-adj和TLS-Dist形态学染色图以及两者差异性基因表达
以往的研究表明WT1介其参与CA-MSC的形成，空间转录组数据表明WT1在TLS dist的基质区内表达上调。表明CA-MSC可能失去淋巴基质细胞的功能或者其支撑TLS形成的能力减弱了（图9）。
图9. TLS-adj和TLS-Dist两个区域 WT1基因表达差异
研究结论
本文通过空间转录组揭示了抗肿瘤免疫过程主要集中在TLS，并且阐述了TLS的状态对肿瘤浸润免疫细胞的影响以及基质细胞在TLS形成过程中的重要作用。
本研究为HGSOC的精准治疗提供方向，诱导TLS的成熟以及其数量的增加未来可能是改善患者生存期值得探索。另外降低CA-MSCs或修饰CA-MSCs正常化或能改善HGSOC患者TLSs形成和功能，进而改善患者的预后。
拓展阅读
