项目文章｜空间组学揭示肝癌DKK1+肿瘤细胞抑制CCL19+成纤维细胞和浆细胞浸润

在肝细胞癌（HCC），肿瘤内免疫浸润在与肿瘤细胞的相互作用中起着关键作用，然而，其表型和相关的空间结构仍然难以捉摸。为了解决这些局限性，近日，中国医学科学院肿瘤医院石远凯教授，北京协和医院临床药理研究中心韩晓红教授作为通讯作者，范光裕、高茹云、谢同济作为共同第一作者，在 Cell Death and Disease （IF=8.1，中科院1区）发表文章，该研究揭示了两种不同的免疫细胞浸润模式：免疫排斥和免疫激活，并确定了导致免疫抵抗的相关因素。裕策生物承担该研究中多重免疫荧光（mIF）检测工作。

1. 空间转录组数据鉴定恶性上皮细胞

本研究纳入8例HCC进行空间转录组（ST）检测，进行了基于拷贝数变异（CNV）模式的inferCNV分析，以特异性地描述恶性细胞与其他细胞类型，鉴定到的肿瘤细胞通过HE鉴定位于肿瘤区域。

图1. 空间转录组数据鉴定恶性细胞

2. 肿瘤内免疫浸润以浆细胞为主

为了探索HCC中免疫浸润的情况，研究评估了每个样本的免疫评分，它反映了免疫浸润的平均水平，4个样本（p5至p8）表现出肿瘤区域的免疫排斥，而其余4个样本（p1至p4）表现出明显的免疫激活，其特征是肿瘤内免疫浸润clusters（图2A）。TCGA bulk RNA数据显示更高的免疫激活 signature 具有更长的OS（图2C），其中IGHG1是浆细胞的marker基因，IGHG1和患者生存有显著相关性（图2D）。IGHG1的空间分布显示，在免疫排斥样本的肿瘤边界处IGHG1表现出高表达水平（图2E），提示肿瘤细胞阻碍浆细胞浸润的潜在机制。

图2. 肿瘤内免疫浸润以浆细胞为主

3. 在肿瘤内免疫浸润中CCL19+成纤维细胞与浆细胞共定位

CCL19在肿瘤内免疫浸润中高表达，为了准确鉴定CCL19的细胞来源，作者通过GEO单细胞数据进行分析，CCL19主要分布在成纤维细胞中，这表明它是一种来源于成纤维细胞的趋化因子（图3A-B）。ST数据显示CCL19和成纤维细胞marker基因DCN的一致性在0.45（图3C），bulk RNA的一致性为0.63（图3D）。为了在蛋白层面验证CCL19的表达，作者进行了多重免疫荧光（mIF）检测，CCL19在DCN+成纤维细胞周围高表达，表明其作为成纤维细胞释放的可溶性趋化因子存在（图3E）。纳入10个免疫激活的样本和10个免疫排斥的样本，IHC检测CCL19的表达。与免疫排斥样本相比，免疫激活样本中CCL19的表达更高（图3F）。在bulk RNA队列中，CCL19水平较高的患者表现出明显更长的生存期，进一步支持其在促进免疫应答中的作用（图3G）。通路分析显示CCL19+成纤维细胞的免疫活性增加（图3I）。

图3. CCL19+成纤维细胞聚集于肿瘤内免疫浸润

4. 浆细胞和CCL19+成纤维细胞的共定位使接受免疫治疗的HCC患者获益

ST和bulk RNA数据显示CCL19 和IGHG1 具有相关性（图4A），为了验证蛋白水平上的相关性，对来自20例HCC患者的样本进行了mIF分析，IGHG1+浆细胞分散在肿瘤区域内，CCL19在这些浆细胞周围表现出高表达水平，表明其作为浆细胞的支持成分的作用（图4B）。IGHG1和CCL19在ST和bulk RNA水平上都与T细胞标志物CD3D表现出显著的相关性（图4C， D）。为了在蛋白水平上验证这些相关性，对来自20例HCC患者的样本进行了mIF分析，显示CD3D+ T细胞聚集在肿瘤区域和肿瘤边界内，IGHG1+浆细胞和CCL19+成纤维细胞分散在这些T细胞中（图4E）。三级淋巴结构（TLS）评分表现出与浆细胞和CCL19+成纤维细胞相似的空间分布，在免疫排斥肿瘤区域表达水平较低（图4G）。此外，研究纳入了最近一项针对肝癌患者免疫治疗的研究的ST数据，与无应答者相比，应答者表现出更高的免疫激活特征（包括CD79A、IGHG1、IGHG2、IGHG3和CCL19），并强调了浆细胞和CCL19+成纤维细胞在免疫治疗应答中的潜在相关性（图4H）。

图4. 浆细胞和CCL19+成纤维细胞共定位给接受免疫治疗的HCC患者带来治疗获益

5. DKK1抑制HCC肿瘤内浸润

作者计算了肿瘤区域内具有不同免疫浸润模式的样品的差异表达基因（图5A），通路分析显示在两种类型的肿瘤区域有不同的生物活性（图5B）。研究继续鉴定肿瘤特异性基因，通过将这些肿瘤标记基因与免疫排斥肿瘤区域的前50相交，确定DKK1符合标准，同时表现出最高的表达水平（图5D），相对于免疫细胞和正常上皮细胞，DKK1在肿瘤细胞中的表达增加（图5E， F）。

随后，作者分析了DKK1在不同免疫浸润水平的样品中的空间表达模式，DKK1主要在肿瘤细胞中表达，而不是在正常上皮细胞和免疫/基质细胞中表达。在免疫排斥样本中，DKK1在肿瘤区域内表达显著，而在免疫激活样本中，其表达水平明显降低。此外，在bulk RNA队列中，DKK1表达升高的患者OS显著缩短（图5H）。IHC结果显示与正常上皮细胞相比，DKK1在肿瘤细胞中的表达升高（图5I， J）。此外，晚期HCC患者的DKK1表达水平高于早期。结果一致表明，与免疫排斥样本相比，DKK1在免疫激活样本中的表达更高（图5K， L）。在免疫排斥样本中对CCL19和DKK1进行了额外的共染色，以进一步证实了研究结论（图5M）。

图5. DKK1抑制HCC的肿瘤内浸润

6. 参与免疫排斥的细胞通讯

p6的所有spots分为9个clusters，包括4个免疫clusters（I1 ~ I4）， 2个正常肝细胞cluster（N1 ~ N2）， 3个肿瘤clusters（T1 ~ T3）（图6A）。三个肿瘤clusters表现出最高水平的outgoing interactions，而四个免疫clusters表现出最高水平的incoming interactions（图6C），这些观察结果表明肿瘤细胞在重塑肿瘤微环境以达到免疫排斥状态中的关键作用。接下来，作者分析了输出和输入信号通路，揭示了肿瘤区域和正常区域之间的不同模式。肿瘤区域激活了多种增殖和转移相关的信号通路（如MK、SPP1、SEMA3、MIF和VEGF）和免疫抑制相关的信号通路（GALECTIN）（图6D）。另一方面，免疫clusters是肿瘤集群信号的主要接受者，而正常区域激活了各种免疫相关的信号通路（包括补体、CCL、CXCL和il - 16），这些信号通路不被肿瘤clusters接收（图6D， E）。肿瘤细胞释放的SPP1与免疫clusters上的CD44、ITGAV、ITGA5、ITGB1和ITGB5相互作用（图6F）。此外，从DKK1+肿瘤细胞释放的MIF激活免疫clusters上的CD74、CXCR4和CD44（图6G）。CXCL家族（包括CXCL9、CXCL12和CXCL8）和CCL家族（包括CCL19、CCL4、CCL5和CCL21）具有较高的相互作用活性（图6H）。值得注意的是，CCL19激活了免疫clusters通讯中的CCR7，提示其在促进和维持免疫浸润中的作用。

图6. 参与免疫排斥的细胞间通讯

本研究证实了HCC肿瘤内浸润模式的特征，并发现DKK1+肿瘤细胞阻碍CCL19+成纤维细胞和浆细胞浸润到肿瘤区域，从而诱导免疫抑制性TME。

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