项目文章｜利用空间组学发现肺癌细胞共定位的研究思路

肿瘤内免疫浸润是影响非小细胞肺癌（NSCLC）免疫治疗反应的关键决定因素，近日，中国医学科学院肿瘤医院石远凯教授作为通讯作者，范光裕、谢同济、唐乐作为共同第一作者，在Clinical and Translational Medicine（IF=7.9，中科院1区）发表文章，确定了非小细胞肺癌的免疫排斥和免疫激活模式，以及CD14+APOE+细胞和MMP7+肿瘤细胞的共定位是免疫抵抗的因素。裕策生物承担该研究中多重免疫荧光（mIF）检测工作。

1. 在空间转录组学数据中鉴定肿瘤细胞

对六名非小细胞肺癌患者的FFPE组织块进行了10x Visium空间转录组（ST）测序，在ST数据中确定肿瘤细胞的存在具有挑战性，特别是在区分肿瘤细胞和正常上皮细胞。为了解决这种情况，该研究进行了推断CNV分析，通过检查其拷贝数变异（CNV）模式，将恶性细胞与其他细胞类型区分开来。结合病理学家的判读，证实了肿瘤区域的准确识别（图1）。

图1. 空间转录组学（ST）数据中恶性细胞的鉴定

2. 非小细胞肺癌免疫激活和免疫排斥模式的鉴定

为了探索NSCLC的免疫浸润情况，研究评估了每个样本的免疫评分，该评分代表了免疫浸润的平均水平，分为免疫激活和免疫排斥模式（图2A）。两个样本（p1和p2）显示肿瘤区域内没有免疫细胞，而其余四个样本显示出明显的肿瘤内免疫浸润，相应的HE图像证实了ST数据中观察到的免疫浸润模式，证实了肿瘤区域内存在免疫细胞clusters（图2B）。

随后，研究应用差异表达基因（DEG）表征免疫浸润过程，虽然这些DEG确实对每个患者都有特异性，但研究的目的是确定可以在患者中推广的免疫激活或免疫排斥的组成。

JCHAIN作为浆细胞标志物，在NSCLC患者的生存中发挥了有利作用，与p3-p6的免疫激活特征一致（图2E）。相比之下，CD14的存在与NSCLC生存率更差有关（图2E）。随后，研究分析了JCHAIN和CD14表达模式的空间分布，CD14高表达的区域通常是免疫排斥的区域，而JCHAIN高表达的区域则表明免疫激活（图2F）。通过分析六个样本中的CD14+和JCHAIN+ spots，发现CD14+ spots中富集促肿瘤途径，包括血管生成、细胞外基质（ECM）受体相互作用和血管内皮生长因子（VEGF）信号传导。相反，促炎途径，如干扰素γ反应和补体激活，在JCHAIN+ pots中富集（图2G）。

图2. NSCLC中免疫激活和免疫排斥模式

3. CD14+APOE+细胞是免疫排斥样本中的主要免疫细胞类型

在免疫排斥样本中，发现APOE在肿瘤内免疫浸润中具有显著表达，APOE水平升高的NSCLC患者OS较低，表明APOE对临床结果有负面影响（图3A）。APOE在免疫排斥样本的肿瘤区域表现出大量表达，而在免疫激活样本中表现出低水平的表达（图3B）。ST数据中APOE与CD14的相关系数为.66，bulk RNA数据中为.64，这表明APOE是NSCLC中CD14+细胞的可靠亚型标志物，为了确认APOE在蛋白水平上的存在，研究对20名非小细胞肺癌患者进行了多重免疫荧光检测，发现CD14和APOE共定位，表明APOE可以作为CD14+细胞的标志物，加强了研究关于APOE与CD14+细胞相关的结论。

为了准确研究APOE的表型，研究收集了多个单细胞数据集（包括GSE148071、GSE127465和GSE131907），并确定了五个主要clusters：上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞和T/B细胞（图3E）。APOE仅在CD14+细胞中的分布证实了其作为典型巨噬细胞标志物的作用，并代表了CD14+APOE+细胞的一个亚型（图3F）。通过比较APOE+和APOE-CD14+细胞，研究构建了一个DEG列表（图3G），通路分析显示，CD14+APOE+细胞中的脂质分解代谢过程增加（图3H），同时血管生成、ECM受体相互作用和缺氧增强。CD14+APOE+细胞表现出谷胱甘肽代谢和PPAR信号通路的上调。相反，CD14+APOE+细胞中的免疫相关途径，如TNFA信号传导、T细胞迁移、补体和炎症反应受到抑制。

图3. APOE+肿瘤相关巨噬细胞（CD14+细胞）是免疫排斥样本中的主要免疫细胞类型

4. MMP7在浸润CD14+APOE+细胞的肿瘤区域高度表达

需要进一步研究确定肿瘤和免疫系统之间的潜在相互作用，这些相互作用可以作为非小细胞肺癌免疫治疗的靶点。首先，研究计算了具有不同免疫浸润模式的样本中肿瘤区域的DEGs（图4A），在免疫排斥样本中发现的DEG之一是MMP7。研究进一步旨在鉴定诱导CD14+APOE+细胞浸润并对肿瘤TME产生免疫抑制作用的肿瘤特异性基因。使用多个单细胞数据集，确定了与免疫细胞和正常上皮细胞相比，肿瘤细胞特有的某些基因，MMP7符合标准，并在以免疫排斥为特征的肿瘤部位表现出最高水平的表达。

随后，研究检查了两种免疫模式样本中MMP7的空间表达模式（图4H）。MMP7主要在肿瘤细胞中表达，而非正常上皮细胞和免疫/基质细胞，这与单细胞分析中的分析一致。在免疫排斥样本中，MMP7在肿瘤区域内显示出显著更高的表达，而在免疫激活的样本中，MMP 7的表达水平显著降低。此外，研究对60名NSCLC的样本进行了IHC，以深入探讨MMP7的临床意义，与正常上皮细胞相比，肿瘤细胞表现出MMP7表达的增加。此外，与早期相比，晚期NSCLC患者的MMP7表达水平升高（图4I，J）。

图4. MMP7在APOE+肿瘤相关巨噬细胞（CD14+细胞）的肿瘤区域高表达

5. MMP7+肿瘤细胞和CD14+APOE+细胞的共定位会恶化NSCLC患者的临床结局

MMP7与CD14之间的关联度为.2，而MMP7与APOE之间的相关性为.47。这表明MMP7与CD14+细胞的APOE+亚群有更密切的联系（图5A，B）。为了在蛋白质水平上证实这种联系，研究对20例非小细胞肺癌患者的样本进行了MMP7和APOE的多重免疫荧光检测。发现与转录组学研究一致，在NSCLC肿瘤区域检测到MMP7+肿瘤细胞和CD14+APOE+细胞的存在（图5C）。选择了五个具有高MMP7+肿瘤细胞的ROI和五个具有低MMP7+肿瘤细胞的ROI，然后计算这些ROI内CD14+细胞和CD14+APOE+细胞的数量，并比较了这两种ROI之间的差异。这种定量显示，MMP7+肿瘤细胞高的区域有更多的CD14+细胞（图5D）。值得注意的是，CD14+APOE+细胞主要位于MMP7+肿瘤细胞高的区域，这表明MMP7+肿瘤细胞和CD14+AOPE+细胞之间存在强烈的共定位模式（图5D）。

随后，作者研究了MMP7+肿瘤细胞和CD14+APOE+细胞的临床重要性。首先，研究了这两种细胞在接受EGFR-TKI治疗的NSCLC患者中的临床意义。从30名转移性肺癌患者的49份临床样本中收集了单细胞数据。与应答者（R）相比，无应答者（NR）患者肿瘤细胞中MMP7和髓系细胞中APOE的表达更高（图5E）。随后，评估了表达MMP7的肿瘤细胞和表达APOE的CD14+细胞预测接受免疫治疗患者的治疗效果能力，ORIENT-3临床试验（NCT03150875）的bulk RNA数据已被纳入，该组包括61名患有晚期NSCLC且首次化疗失败的患者，在接受免疫治疗的患者中，MMP7和APOE在NR中都更丰富（图5F，G），MMP7或APOE水平较高的患者治疗效果明显较差（图5H，I）。

图5. MMP7+肿瘤细胞和CD14+APOE+细胞共定位的NSCLC患者临床结局更差

6. 参与免疫排斥的细胞间通讯

p1中的所有spots分为九个clusters，包括四个免疫clusters（I1至I4）、两个正常上皮clusters（N1和N2）和三个肿瘤cluster（T1至T3）（图6A）。三个肿瘤clusters表现出最高水平的外向相互作用，而四个免疫clusters表现出了最高水平的内向相互作用（图6C）。这些观察结果表明，肿瘤细胞在改变TME以产生免疫排斥状态方面起着至关重要的作用。免疫clusters是肿瘤clusters信号的主要接受者（图6E）。MMP7+肿瘤细胞释放的MIF激活了免疫clusters上的CD74、CXCR4和CD44（图6F）。MIF信号通路已被确定为细胞间相互作用的关键参与者，对炎症和癌症至关重要。SEMA3信号通路在细胞间通讯中也显示出增强的活性（图6G）。该信号通路由三种分泌蛋白（SEMA3A、SEMA3B和SEMA3C）组成，它们与肿瘤转移和不良治疗反应有关。作者对p2空间转录组数据和数据库中单细胞转录组的细胞通讯分析显示与p1空间转录组数据的一致，证实MMP7+肿瘤细胞与免疫细胞表现出不同的通信模式，特别是通过MIF信号通路。

图6. 细胞-细胞通讯涉及免疫排斥

在这项研究中，通过空间转录组和多重免疫荧光等平台，确定了NSCLC中两种不同的浸润模式：免疫排斥和免疫激活。CD14+APOE+细胞被鉴定为免疫排斥样本中的主要细胞类型，MMP7+肿瘤细胞与CD14+APOE+细胞共定位，对免疫治疗反应较差的NSCLC患者表现出较高的APOE+ Tumor-associated macrophages (TAMs) 和MMP7+肿瘤细胞浸润。

范光裕 博士 

中国医学科学院肿瘤医院

• 中国医学科学院肿瘤医院  肿瘤学专业 医学博士
• 导师石远凯教授   从事肺癌及原发性肝癌免疫微环境相关研究
• 以一作和共一发表 SCI  文章 9  篇， 累计影响因子 70.4 分