Immunity封面文章 | 单细胞+CosMx空转解析类风湿关节炎中的髓系树突状细胞

研究方法

scRNA测序和CITE测序：Healthy n=7、Active RA n=18、Remission RA n=9

DC流式质谱：Active RA n=15、Remission RA n=8

IF免疫荧光：Healthy n=5、Active RA n=6、Remission RA n=6

CosMx SMI单细胞原位空间转录组（960 plex）：Active RA n=3）、Remission RA n=3

其他细胞动物实验：MIR155过表达、小鼠肠道淋巴插管模型实验、细胞初始共培养实验等

研究亮点

• AXL+ DC2s具有耐受性表型，存在于健康人的滑膜组织衬里下方.

• iDC3s在RA的增生性衬里中定植，激活Tem和/或Tph细胞.

• CCR7+ DC2s占据RA亚衬里淋巴样生态位，与初始T细胞相互作用.

• 血液中ST-DC3s前体的特征可预测RA在缓解期间的复发.

摘  要

目前的类风湿性关节炎（RA）治疗未能恢复免疫耐受。研究人类滑膜组织（ST）中的树突状细胞（DC）群体可能会揭示在RA中恢复耐受的途径。

通过使用ST活检的单细胞和空间转录组学，以及共培养系统，我们识别出具有不同功能的条件和生态位特异性DC簇。

在健康组织中，耐受性AXL+ DC2s存在于衬里生态位中。

在活动性RA中，增生性衬里生态位被炎症性DC3s占据，这些细胞激活了CCL5阳性的效应记忆T细胞，从而促进滑膜炎的发生。在亚衬里层出现的淋巴样生态位中，CCR7+ DC2s富集，它们与初始T细胞相互作用，可能驱动新的效应T细胞的局部扩增。

在缓解期，这些致病生态位得到缓解，但耐受性DC2s未能恢复，并且在复发前出现了ST-DC3簇血液前体的激活。

针对致病性DC3s或恢复耐受性DC2s可能有助于在RA关节中恢复免疫稳态。

研究结果

1. 人类ST中鉴定出丰富的髓系DC群体

对健康（n = 7）、活动性 RA（n = 18）和疾病持续缓解期 RA（n = 9）ST 活检中的所有细胞或 CD45^pos 细胞进行了 scRNA-seq 和单细胞转录组+表面蛋白测序技术（CITE-seq）。对 ST-DCs 进行无偏重新聚类，在健康、活动性 RA 和缓解期 RA 滑膜中鉴定出了 SIGLEC6^pos pre-DC2s、DC1s 和 14 个髓样 DC 簇（图 1B-1D）。细胞轨迹分析进一步揭示了它们与外周血（PB）DC亚群的发育关系。

图1. 单细胞组学鉴定ST髓系DC亚群表型不同的簇

2. 健康 ST 包含 AXL^pos DC2 亚群

健康的 ST 由常驻的 AXL^pos DC2 亚群组成，该亚群具有耐受性特征，可能对维持局部免疫耐受至关重要。在健康状态下，AXL^pos DC2占主导地位，约占所有DC的40%（图1G），并代表了位于保护性衬里层TREM2^pos STM下的大多数DC（图1H）。AXL^pos DC2亚群在活动性RA中显著减少，尤其是在难治性的RA中（图1I），并且在持续缓解中不再恢复（图1E-1F）。

图1. 单细胞组学鉴定ST髓系DC亚群表型不同的簇

3. 活动性 RA 的 ST 富含 iDC3s

通过流式细胞术验证了 ST-DC2 和 DC3/iDC3 亚群在其他滑膜活检组织（n = 23）中的频率。证实在 RA 病理过程中，ST 富集在 iDC3 表型亚群中，而在 RA 缓解期，iDC3 表型亚群会消失（图1K）。

图1. 流式细胞术验证了 ST-DC2 和 DC3/iDC3 亚群在其他滑膜活检组织中的频率

4. 活动性 RA 的 ST 富集 LAMP3^posCCR7^pos DC2 亚群

在活动性RA中，两个共同表达 MIR155 和 LAMP3 的 CCR7 阳性 DC2（CCR7^posLAMP3^pos DC2） 亚群增加（图2A）。将 ST 单细胞数据集与骨髓细胞（MNP）单细胞 RNA（MNPVerse）整合在一起证实 ST CCR7^posLAMP3^pos DCs 是 mReg（图 2C）。通过细胞轨迹分析和小鼠肠道淋巴插管模型实验表明，mReg通过高度活化的 CCR7^posMIR155^pos 中间阶段从浸润的 DC2 中分化出来，MIR155被确定为这一过程的潜在调节因子（图2E-2L）。

图2. MIR155介导CCR7^posMIR155^pos 中间阶段分化成mReg

5. 不同的髓样 DC 定位于不同的 ST 璧龛（niche）

为了阐明组织中不同髓系 DC 亚群/亚群的功能，研究者绘制了它们在 ST 龛中的定位图，并评估了它们与特定 T 细胞亚群的相互作用。对活动期、未接受治疗 和疾病缓解期 RA 患者的 ST 活检组织进行了单细胞空间转录组学研究（图S5A）。

图S5. CosMx单细胞空间转录组学研究

空间转录组确定了13类细胞亚群和 8 个不同的 ST 邻域（niches）（图3A-3D）。与缓解期相比，活动期RA含有更大的富含髓系的衬里龛、淋巴龛和富含血浆的龛。相反，与活动性RA相比，缓解期RA的脂肪细胞龛更大（图3E）。

图3. 不同的髓系DC簇定位于不同的ST区

这些璧龛有不同DC亚群的分布情况。DC尤其富集于富含骨髓的衬里、TGF-β^pos 富含骨髓的亚衬、骨髓/FLS 亚衬和淋巴龛（图3G）。CCR7^pos DC2（mReg/MIR155^pos）明显富集于淋巴龛，而其余的 DC2（CCR7 阴性）则位于 TGF-β^pos 髓样丰富的亚衬底龛。DC3 及其 iDC3 表型在富含髓系的衬垫龛中明显富集（图 3I 和 3J）。总之，ST-DC 亚群呈现出组织龛特异性分布，表明它们在调节适应性免疫方面具有不同的局部功能。

图3. 不同的髓系DC簇定位于不同的ST区

6. 整合 RA ST 中 DC 和 T 细胞亚群的生物学特性

为了推断活动性RA组织中绘制的DC亚群的功能，接下来绘制了特定的CD4^pos T细胞滑膜簇。利用单细胞数据发现了十二个不同的 CD4^pos T 细胞群（图4A和4B）。以 CCL5 表达为特征的 Tph 细胞表型在接受治疗的早期 RA 患者中占主导地位，而经典的 CXCL13^posCCL5 阴性 Tph 细胞在持续耐受治疗的滑膜炎患者中占主导地位（图 4F 和 4G），这表明在疾病进展过程中，急性 CCL5 阳性 Tph 表型有可能演变为经典 Tph 表型。

图4. 不同关节状态下ST CD4^pos T细胞簇的分布

邻域分析推断出不同ST-DC亚群的T细胞刺激功能。对滑膜中DC/T细胞相互作用的总体评估显示，与缓解期RA组织相比，活动期RA中髓样ST-DC与CD4^pos T细胞之间的直接相互作用更多（图5B）。CCR7^pos DC2s（包括 mReg 及其 MIR155^pos 中间阶段）和 iDC3s 与 T 细胞的关联具有最高的统计学意义，可能表明它们具有最强大的 T 细胞刺激功能（图 5C ）。

图5. ST-DC亚群与滑膜T细胞的相互作用模式不同

7. mReg DC2 与 ST 淋巴龛中的幼稚 T 细胞相互作用

CCR7^pos DC2s（mReg/MIR155^pos）与在淋巴样微环境中与初始T细胞、Treg细胞和CXCL13阳性CCL5阴性Tph细胞相互作用（图 5D-5H）。这些相互作用可能促使初始T细胞向效应致病功能分化，是免疫应答诱导的负反馈机制的一部分。

图5. ST-DC亚群与滑膜T细胞的相互作用模式不同

8. ST-iDC3s 激活滑膜增生衬里层中的 CCL5^pos Tem 和 CCL5^pos Tph 细胞

活动期RA滑膜中富含髓系细胞的增生衬里层中的iDC3优先与CCL5阳性Tem细胞相互作用，在较小程度上与CCL5阳性Tph细胞相互作用（图6A-6D）。组织空间转录组、初始共培养和细胞轨迹分析，表明 ST-iDC3s 激活了 CCL5^pos Tem 细胞，它们在增生的、富含髓系的滑膜龛中分化成 CCL5^pos Tph 细胞的潜在因素（图 6F-6K）。

图6. 滑膜组织iDC3支持CCL5^pos-Tem/CCL5^pos-Tph细胞的激活

9. PB iDC3 的炎症特征可预测缓解期 RA 的疾病复发

在治疗停药后的疾病发作人群队列（图7A），针对利用 scRNA-seq 中的 399 个免疫基因集对血液髓系细胞亚群及其表型进行了去卷积（图7B 和 7C）。根据复发或缓解的结果，在外周血中发现了一种促炎基因特征，能够预测类风湿性关节炎（RA）在缓解期的复发（图7D-7I）。这一特征主要集中在PB iDC3及其在组织中成熟的ST-iDC3亚群中，表明它们可能在滑膜炎的起始过程中发挥作用。 

图7. 缓解期RA患者PB-iDC3s的转录组学特征可预测病情发作

研究结论

研究为ST髓系DC亚群在维持健康组织耐受和驱动RA自身免疫中的作用提供了有价值的见解。

研究结果提示了靶向致病DC亚群和恢复RA关节免疫稳态的潜在治疗策略。

未来需要进一步研究以理解这些过程的潜在机制并开发更有效的RA治疗方法。