在抗击非小细胞肺癌（NSCLC）的战场上，免疫检查点阻断（ICB）疗法虽为患者带来新希望，但耐药问题仍是治疗中的难题。
近日，同济大学附属上海市肺科医院张鹏教授、张乐乐副研究员，同济大学生命科学与技术学院王晨飞教授，同济大学医学院孙毅教授和中科院生化细胞所曾安研究员为共同通讯作者，同济大学附属上海市肺科医院严以律博士后，胡俊杰博士研究生，同济大学生命科学与技术学院孙冬青博士，中科院生化细胞所陈悦博士为共同第一作者，在 Nature Genetics（IF=31.7，中科院1区）发表文章，通过单细胞测序联合空间多组学分析深入探索了NSCLC患者对免疫联合化疗的耐药机制。
裕策生物承担该研究中NanoString GeoMx® DSP WTA检测和分析工作。
研究方法
scRNA-seq：19例新辅助ICB联合化疗患者治疗前后26个组织样本，其中治疗后19个样本为手术样本（6个response和13个non-response），治疗前7个穿刺活检样本（3个response和4个non-response）；
Bulk RNA-seq：新辅助ICB联合化疗患者治疗前15个样本和治疗后15个样本；
NanoString GeoMx® DSP WTA：新辅助ICB联合化疗患者治疗前的14个样本；
10x Genomics Visium：新辅助ICB联合化疗患者治疗后的17个样本；
图1. 技术路线
研究亮点
综合多组学分析：结合单细胞转录组和空间转录组技术，全面分析了NSCLC的肿瘤微环境。
肿瘤细胞状态与耐药性关联：发现特定的肿瘤细胞状态与患者对免疫化疗的耐药性有关。
肿瘤微环境中的细胞相互作用：揭示了肿瘤细胞、巨噬细胞和成纤维细胞之间的相互作用及其在耐药性中的作用。
三级淋巴结构（TLSs）的异质性：识别了TLSs在TME中的不同成熟阶段，以及它们与治疗反应的关系。
潜在的治疗靶点：识别了COL11A1+CAFs和SPP1+巨噬细胞作为克服免疫治疗耐药性的潜在靶点。
预后生物标志物的发现：提供了可能预测患者对免疫化疗反应的生物标志物，有助于个性化治疗策略的制定。
研究结果
1. 肿瘤细胞状态与ICB联合化疗耐药的相关性
scRNA-seq结果分析， 将恶性上皮细胞分为14个亚群，确定了NRF2 taget和IFNγ相关的肿瘤细胞状态与患者对ICB联合化疗的治疗响应密切相关。
治疗前non-response患者的NRF2 taget score 显著高于response患者，而IFNγ score则相反。
研究进一步通过GeoMx DSP数据，也发现IFNγ和NRF2 target相关基因的显著差异，并且分别在应答者和无应答者中富集。
多组学结果分析也表明肿瘤细胞的状态和复杂多变肿瘤微环境形成潜在相关。
图2. scRNA-seq和DSP结果分析肿瘤细胞状态与ICB联合化疗耐药的相关性
2. 治疗后非小细胞肺癌空间图谱
根据HE把组织划分了四个不同的区域，包括肿瘤核心、浸润性边缘、孤立性肿瘤和肿瘤基质区域。
通过对Visum无监督聚类和细胞注释，确定了15种细胞类型，并通过空间可视化确定了他们的空间位置和潜在的相互作用。
图3. 治疗后非小细胞肺癌空间图谱
3. COL11A1+CAFs的空间定位及潜在的促癌机制分析
通过scRNA-seq数据分析表明，ADH1B+CAFs表现出一种特异性iCAF表型具有特定的代谢程序，而COL11A1+CAFs表现出促肿瘤myCAF表型。
空间组学分析，确定了COL11A1+CAFs在肿瘤边界的积累。
图4. COL11A1+CAFs的空间定位及潜在的促癌机制分析
4. SPP1+巨噬细胞和COL11A1+CAFs空间相互作用阻断T细胞浸润
scRNA-seq数据显示COL11A1+CAFs和SPP1+巨噬细胞丰度成正相关，且COL11A1+CAFs和SPP1+巨噬细胞在治疗前和治疗后无反应者中比例显著升高。
空间组学数据显示与COL11A1+CAFs一样，SPP1+巨噬细胞也在肿瘤边界处聚集，表现出较低的凋亡水平。
通过SPP1+巨噬细胞与COL11A1+CAFs之间的细胞间相互作用分析发现，SPP1-CD44富集，SPP1分泌促进CAF的增殖和活化,并增加胶原蛋白的沉积。
COL11A1+CAF-low区，T细胞浸润水平较高，SPP1-CD44的共定位水平也明显低于COL11A1+CAF-high区。这提示SPP1+巨噬细胞可能与COL11A1+CAFs协同保护肿瘤阻断T细胞浸润。
TCGA-LUAD数据分析表明，表现出高水平的COL11A1+CAFs和SPP1+巨噬细胞的患者均表现出更差的生存。
图5. SPP1+巨噬细胞和COL11A1+CAFs空间相互作用阻断T细胞浸润
5. TME中三级淋巴结构（TLSs）不同状态的临床意义
采用K-means聚类来区分不同的TLSs成熟阶段，包括早期淋巴样聚集体(LTi marker高表达和细胞因子低表达)，activated TLSs（细胞因子高表达），declining TLSs（细胞因子表达减少）和late TLSs (细胞因子极低表达)。
activated TLSs与更好的预后相关，而缺氧的微环境抑制了TLSs的发展，并与不良预后相关。
图6. TME中三级淋巴结构（TLSs）不同状态的临床意义
研究结论
这项研究利用非小细胞肺癌新辅助免疫联合化疗治疗前后的肿瘤样本，通过单细胞测序联合空间多组学系统地揭示了非小细胞肺癌免疫联合化疗耐药的关键因素，为后续肺癌免疫治疗研究提供了珍贵的数据支持，也为后续非小细胞肺癌个性化治疗提供了理论依据。
参考文献
[1] Yan Y, Sun D, Hu J, Chen Y, Sun L, Yu H, Xiong Y, Huang Z, Xia H, Zhu X, Bian D, Sun F, Hou L, Wu C, Fan OR, Hu H, Zeng A, Zhang L, Sun YE, Wang C, Zhang P. Multi-omic profiling highlights factors associated with resistance to immuno-chemotherapy in non-small-cell lung cancer. Nat Genet. 2024 Dec 10. pii: 10.1038/s41588-024-01998-y.
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