肺腺癌（LUAD）是肺癌中常见且复杂的亚型，肿瘤微环境（TME）在其发生、发展及治疗反应中起着关键作用。
由东京大学、国立癌症中心医院和顺天堂大学等研究人员联合撰写，于2024年12月6日发表在Nature Communications上的Spatially resolved gene expression profiling of tumor microenvironment reveals key steps of lung adenocarcinoma development一文，通过空间组学技术对30例肺腺癌患者肿瘤微环境进行空间维度分析，揭示了肺腺癌发展的关键步骤，并通过对非侵袭和后期侵袭阶段变化的研究，阐述了肿瘤微环境通过影响肿瘤细胞的生存、适应和转移能力在肺腺癌的发展中起到至关重要的作用。
研究方法
1. 10x Genomics Visium
对于浸润性肺腺癌（IA）病例，使用了来自 8 名患者的冷冻手术标本（LUAD 系列）。其中部分标本（LUAD No.2 - 4）还制备了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织用于后续分析。
对于早期肺腺癌（AIS和MIA）病例，使用了22名患者的冷冻组织（TSU系列）。
2. PhenoCycler
对FFPE组织（LUAD No.2 - 4）进行分析，制备厚度为5μm的组织切片，与Visium分析相邻。
对冷冻组织（TSU系列中的TSU-23、24、28、30、31 和 35）进行分析，制备厚度为10μm的组织切片，与Visium分析相邻。
3. 10x Genomics Xenium
FFPE组织（LUAD No.2和3）切成5μm厚度的切片放置在Xenium slide 上进行分析。
FF组织（LUAD No.14、16、17 及TSU系列）切成10μm厚度的切片放置在Xenium slide上进行高分辨转录组分析。
研究亮点
肿瘤细胞转录组多样性与微环境相关，肿瘤细胞在不同位置和环境中转录差异显著。
肿瘤细胞在微环境中的适应能力使其能够突破免疫细胞屏障，促进肿瘤进一步发展。
肿瘤细胞与浸润性免疫细胞间的相互作用，是肺腺癌发展的重要因素。
研究结果
1. KRAS突变，粘液性肺腺癌空间转录组特征
组织区域差异：
通过Visium分析分为11个簇，正常或高分化区域表达NAPSA等肺泡上皮细胞标志物，粘液性区域高表达MUC5AC。病理上左右两部分不同，左侧NKX2-1 活跃，右侧NKX2-1缺失、HNF4A活跃，肿瘤细胞发生转分化产生粘性蛋白。
边界区域特征：
边界区域有炎症反应簇高表达炎症相关基因如IFITM1和IFI6，肿瘤细胞激活IDO1应对免疫细胞攻击，同时粘液性与CAF丰富侵袭区域边界（图2）高表达细胞外基质重塑和抗失巢凋亡相关基因如SPINK1和MMP7，肿瘤细胞与CAF相互作用重塑细胞外基质利于侵袭。
图2. 肺腺癌（LUAD No.2）的空间组织结构
2.EGFR 突变，非粘液性肺腺癌空间转录组特征
肿瘤起源与扩展表现：
肿瘤细胞可能起源于簇1或9，在向其他区域扩展时，开始表达更恶性标志物（如TNC、TGFBI）以及上皮-间质转化（EMT）标志物（如RHOB、VIM），意味着其恶性程度逐渐增加。
免疫细胞区域特点：
免疫细胞丰富区域情况复杂，不同子区域免疫细胞分布有差异，且部分区域细胞间相互作用会诱导肿瘤细胞EMT、影响免疫治疗效果，另外在其他区域有的无肿瘤细胞含幼稚免疫细胞标志物，有的具侵袭性且免疫细胞被排除，肿瘤细胞借助成纤维细胞作用扩散。
图3. 肺腺癌（LUAD No.3）的空间组织结构
3. 跨病例或切片的 TME 评分分析
TME评分体系构建与基因选择：
基于基因表达模式差异精心选择基因，运用 PAGE 分析将其空间表达模式转换为活性评分，从而构建了一套量化肿瘤微环境特征的评分体系。
病例间TME特征比较与分析：
通过对不同标本的比较，发现LUAD No. 2的FF切片高分化细胞面积最大，LUAD No. 3的FFPE切片A免疫细胞区域最突出。在关注侵袭性区域时，如LUAD No. 14最大侵袭性区域分化差，LUAD No. 3的FFPE切片B右侧侵袭性区域除CAF外细胞表达侵袭相关基因。这些结果表明，转录组谱评分能够有效地剖析病理检查中难以察觉的肿瘤微环境特征差异，并且发现M 巨噬细胞特征与肿瘤细胞侵袭性/增殖性特征存在相关性，表明了巨噬细胞在肿瘤微环境中的重要作用及其与肿瘤细胞行为的关联。
图4. 跨病例或切片肿瘤微环境（TME）评分
4. 肿瘤微环境局部特征的相互关联
癌症进展途径与TME评分整合分析：
将癌症进展途径纳入TME评分体系，并进行轨迹分析。结果显示恶性与CA 特征呈正相关，侵袭与免疫细胞特征呈负相关。这意味着肿瘤细胞的恶性进展与CAF的支持作用密切相关，而免疫细胞在一定程度上能够抑制肿瘤细胞的侵袭。肿瘤细胞相关变化与免疫细胞活性峰值区域的重叠区域中的病理表型变化相关，进一步强调了免疫细胞作为肿瘤细胞扩张的重要屏障作用，肿瘤细胞需要通过改变自身表型来突破免疫细胞的限制，这一过程涉及到复杂的基因表达调控和细胞间相互作用。
图5. 不同肿瘤微环境（TME）下的肿瘤进展
5. IA病例中TME在单细胞水平的验证分析
单细胞分辨率下的细胞类型特征与相互作用：
利用Xenium分析能够精确区分肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞等不同细胞类型。在LUAD No. 2中，发现肿瘤细胞从NKX2-1阳性转变为HNF4A阳性且相邻排他表达，免疫反应和高IDO1表达相关，存在 CCL22 阳性细胞（可能为DC或T细胞）与IDO1共同保护肿瘤细胞，部分CD8 + T细胞仍具细胞毒性活性。这从单细胞水平证实了肿瘤细胞与免疫细胞之间的复杂相互作用关系，肿瘤细胞通过激活特定基因和招募免疫细胞来建立免疫抑制环境，同时免疫细胞也在不断地对肿瘤细胞进行攻击和监视，这种相互作用在单细胞水平上表现出高度的动态性和复杂性。
细胞间相互作用与基因激活调控：
在免疫细胞攻击边界区域时，肿瘤细胞中RHOV等基因表达激活，这可能是肿瘤细胞对免疫攻击的一种应激反应，通过激活这些基因来增强自身的生存能力或促进恶性转化。在LUAD No. 2的CAF丰富侵袭区域，肿瘤细胞和CAF 分别表达与侵袭和基质重塑相关基因（如MMP7和CXCL14），两者可能共同参与细胞外基质重塑，排除抗肿瘤免疫细胞，这再次表明肿瘤细胞与CAF之间的协同作用在肿瘤侵袭过程中的重要性，以及它们如何共同应对免疫细胞的防御。
图6. LUAD No. 2的肿瘤微环境空间和转录组特征
6. 早期肿瘤的TME 状态
早期肿瘤TME特征与基因表达差异：
AIS/MIA 肿瘤多为高分化，免疫细胞区域与IA相比并不低，但“恶性”区域（增殖和侵袭区域总和）明显较小且呈稀疏分布“斑点” 状。应激反应、侵袭相关通路、血管生成信号等相关通路被上调，与IA病例存在不同基因表达，如基质和免疫细胞相关基因在 AIS/MIA 的“可能恶性”区域高表达，免疫细胞更积极浸润。这表明早期腺癌中肿瘤细胞已经开始发生一些与恶性进展相关的基因表达变化，但整体上仍处于相对受控的状态，免疫细胞在早期阶段可能对肿瘤细胞的增殖和侵袭起到一定的抑制作用。
早期肿瘤中细胞间相互作用变化：
AIS/MIA 的“可能恶性”区域中多种免疫细胞相关特征，如炎症免疫细胞（B细胞、M1样肺泡巨噬细胞等）的浸润，以及相关促炎因子（如CCL19、FCGR3A等）的表达。这些结果说明早期腺癌中炎症免疫细胞可抑制肿瘤细胞，突破屏障的肿瘤细胞向外扩展时面临更强烈免疫攻击，肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用对肿瘤的发展方向具有重要影响。
图7. 早期病例的TME 特征
研究结论
文章通过Visium、PhenoCycler和Xenium技术的综合运用，对肺腺癌患者的肿瘤组织进行空间转录组分析，研究在不同分辨率下肿瘤细胞与微环境的相互作用揭示了肿瘤细胞与微环境相互对肺癌发展的重要影响和不同阶段肺腺癌微环境特征及肿瘤变化，并着重强调了肿瘤微环境在肺腺癌发展中的关键作用和癌症分类诊断结合微环境信息可实现更精准的病理诊断的观点，对深入理解肺腺癌的发病机制、改进癌症分类和治疗提供了重要依据，并为癌症发现和药物开发提供了理论支持。
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