食管癌（EC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一。食管鳞状细胞癌（ESCC）是亚洲人群最常见的EC组织亚型。了解ESCC的逐步进展对于早期干预至关重要。
2024年12月，中科院1区Top期刊Genome Medicine（IF=10.4）在线发表一项重要研究成果[1]：苏州大学附属第一医院联合裕策生物研究团队运用Bruker NanoString空间转录组学技术揭示了ESCC在恶性转化过程中发生的转录和免疫景观改变，并鉴定了与ESCC发生相关的生物标志物。
本研究的通讯作者为苏州大学附属第一医院马海涛教授、郭凌川教授、冯宇教授及裕策生物李娜博士。
研究概览
样本情况：
24例pT1 ESCC， 每例样本均包含4个组织区域：正常组织（N）、低级别异常区（L）、高级别异常区（H）及癌组织（T）
主要研究方法：
GeoMx DSP空间转录组（11例）
DSP结果验证：
IHC（20例）、CosMx SMI单细胞空间转录组（4例）、公共单细胞数据库、功能实验
研究结果
1、ESCC发生的空间转录组变化
为探寻ESCC发生过程中的分子变化，采用GeoMx DSP技术对11名pT1 ESCC患者的44个 (N、L、H和T各11个样本) 食管切除标本进行了分析。每类样本选择了3个ROI（图1A、B），并使用segmentation策略将每个ROI分割为上皮区（PanCK+/CD45-）、免疫细胞区（PanCK-/CD45+）及非免疫细胞基质区（PanCK-/CD45-/SYTO13+）（图1C）。tSNE表明各segment AOI明显分离（图1D）。从各segment的基因表达可视化图可知，在ESCC发生过程中，大量基因的表达降低，特别是在上皮区（图1E），反映了恶性转化过程中生理特征的共同丧失。
图1. 早期ESCC的DSP分析
2、上皮和基质区与ESCC发生相关的通路
为全面评估从正常组织到癌发生的变化，对WikiPathways数据库的数据集进行了通路富集分析。共鉴定到7个通路簇（C1-C7）与恶性转化有不同的关联（图2）。C1和C2主要富集在上皮区活跃的通路。C1通路包括与细胞增殖和DNA损伤修复相关的生物过程，这些过程在ESCC发展期间持续增加。C2中聚集的大多数通路与线粒体功能有关，线粒体功能在上皮区恶性转化过程中降低。C5和C6的通路与基质区有关。聚集在C3、C4和C7的通路在上皮和基质区均活跃，表明与肿瘤进展的关系各不相同。
图2. 上皮及基质区与ESCC发生相关的生物学通路
3、ESCC进展过程中的免疫相关改变
免疫相关的WikiPathways的富集在恶性转化过程中发生了变化，反映了免疫微环境的改变（图3A）。在从正常组织向癌的过渡过程中，基质区与细胞因子及炎症相关的信号通路上调，而与先天免疫相关的通路在非免疫细胞基质区持续上调。在从正常组织转化为癌的过程中，免疫细胞区CD4+ T细胞、中性粒细胞和肥大细胞的相对比例降低（图3B）。相反，在肿瘤发生过程中，免疫细胞区巨噬细胞和调节性T细胞以及非免疫细胞区成纤维细胞的相对比例增加（图3B）。在ESCC进展过程中，观察到促肿瘤M2巨噬细胞的比例增加（图3C）。IHC结果进一步证实从正常组织到ESCC，CD68和CD163的表达增加（图3D，E）。因而，这些发现进一步证实与肿瘤进展相吻合的免疫抑制微环境的出现。
图3. 与ESCC进展相关的免疫改变
4、巨噬细胞亚群特征及巨噬细胞与肿瘤上皮细胞的相互作用
肿瘤的发生和进展可能受到巨噬细胞表型的影响。分析公开可用的ESCC scRNA-seq数据集证实肿瘤组织的巨噬细胞比例明显高于正常组织（图4A），与DSP结果一致（图3B）。共鉴定出5个巨噬细胞亚群（图4B），巨噬细胞亚群的组成在正常和肿瘤组织之间差异较大（图4C）。拟时序分析鉴定了四个不同的分支（图4D）。5个巨噬细胞亚群分散在不同分支（图4E）。Macro.4表现出最低的伪时间值，并占据初始位置，表明其作为其它亚群发育起源的作用。此外，分析另外两个公共ESCC scRNA-seq数据集结果表明上皮和巨噬细胞之间存在复杂的细胞间相互作用（图4F）。scRNA-seq和CosMx SMI数据均证实，配体-受体对巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）-（CD74+CXCR4）和MIF-（CD74+CD44）表现出特别高的相互作用得分（图4G，H）。接下来将上皮细胞进一步细分为6个亚群（图4I）。MIF信号通路显示巨噬细胞和每个上皮亚群之间存在强烈的相互作用（图4J）。因此，抑制MIF-CD74轴有望阻止肿瘤发生，并可能成为治疗ESCC的可行治疗策略。
图4. 巨噬细胞亚群的表征及巨噬细胞与肿瘤细胞的互作
5、鉴定与ESCC逐步进展相关的生物标志物
为了阐明从正常组织到癌组织逐步进展过程中基因的表达变化，比较了各组织学类型segment之间的差异基因表达。在上皮区，N和L以及L和H之间分别有364和89个差异表达基因（图5A）。在基质区，N和L以及L和H之间仅观察到微小差异（图5B，C）。而T在上皮和间质区均观察到大量基因表达的显著改变（图5A-C，右图）。这些发现支持了ESCC的起始与恶性上皮细胞和邻近基质细胞的转录变化有关的观点。DSP及SMI数据均发现上皮区的DTX3L及基质区的BST2的表达在ESCC发生过程逐步上调（图5D，E）。IHC进一步在蛋白水平进行了证实（图5F，G）。因而，空间转录组成功地筛选出了可用作ESCC早期干预的临床空间生物标志物。
图5. 鉴定与ESCC逐步进展相关的差异表达基因
6、体内及体外实验均证实DTX3L和BST2在加速ESCC进展中的作用
功能研究可以深入了解基因对促进癌症进展的分子机制。为了评估DTX3L及BST2在ESCC进展中的作用，构建了DTX3L及BST2敲除细胞系及小鼠。体内及体外实验均证实DTX3L和BST2加速ESCC进展并影响巨噬细胞极化（图6）。
图6. 体外及体内实验验证候选基因在加速ESCC进展的作用
总结
本研究通过空间转录组分析，阐明了与ESCC进展相关的动态生物学过程和细胞图谱，并建立了一个强有力的框架，可用于识别ESCC发生过程中持续改变的生物标志物，从而为新的治疗策略铺平了道路。此外，还探索了肿瘤相关巨噬细胞在ESCC发生中的作用。所以，此研究结果有助于预防和及时干预ESCC的发生。
参考文献：
1. Li R, Li N, Yang Q, Tong X, Wang W, Li C, et al. Spatial transcriptome profiling identifies DTX3L and BST2 as key biomarkers in esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis. Genome Med. 2024;16(1):148.
专家介绍
马海涛 教授
苏州大学附属第一医院
郭凌川 教授
苏州大学附属第一医院
冯宇 教授
苏州大学附属第一医院
拓展阅读
