文献精读： 巨噬细胞和成纤维细胞之间的烟酰胺代谢博弈调控胃癌微环境

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免疫检查点阻断（ICB）在晚期胃癌（GC）的治疗中取得了突破。然而，胃癌中显著的异质性，尤其是肿瘤微环境的异质性，表明抗肿瘤反应是多因素相互作用的结果。通过转录组分析和动态血浆样本分析，中国南方医科大学的石敏团队发现了肿瘤微环境中的一种代谢“博弈”机制，这表现在烟酰胺代谢的双重预后意义上。具体来说，分别表达限速酶烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）和烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）的巨噬细胞和成纤维细胞调节烟酰胺/1-甲基烟酰胺（NAM/MNAM）比率以及CD8⁺T细胞功能。机制上，烟酰胺N-甲基转移酶通过NOTCH通路的转录因子RBP-J进行转录激活，进一步被巨噬细胞衍生的含有烟酰胺磷酸核糖转移酶的细胞外囊泡（EVs）通过SIRT1/NICD轴抑制。通过自体注射细胞外囊泡操纵烟酰胺代谢，恢复了胃癌中CD8⁺T细胞的毒性和抗PD-1反应。

（A）火山图展示了烟酰胺代谢物在单变量Cox分析中的预后意义。X轴代表危险比（HR），Y轴代表对数转换的P值。展示了烟酰胺代谢物在单变量Cox分析中的预后意义。NAM与更好的预后相关，而MNAM与较差的预后相关，反映出烟酰胺代谢物对GC的双重影响。（B）通过ELISA测量GC患者的血浆NAM/MNAM比率。发现响应ICB治疗的GC患者的血浆NAM/MNAM比率显著高于无反应患者。（C）接受免疫治疗前后GC患者配对血浆样本的NAM/MNAM比率。分析表明，响应治疗的患者在治疗后NAM/MNAM比率增加，而无反应患者比率下降。（D）Kaplan-Meier生存曲线展示了NAM/MNAM比率在GC患者中的预后价值。显示高NAM/MNAM比率的GC患者具有更长的无进展生存期。（E-G）接受免疫治疗的3位GC患者在疗效评估时的影像特征（左）和血浆NAM/MNAM比率（右）。X轴代表测量日期，Y轴代表NAM/MNAM比率。红色箭头显示治疗过程中变化的病变。结果显示，治疗有效时NAM/MNAM比率增加，疾病进展时比率下降。（H-K）通过ELISA测量接受ICB治疗的非小细胞肺癌（NSCLC）或食管癌（EC）患者的血浆NAM/MNAM比率。ICB治疗后的NAM/MNAM比率（H和J）或配对血浆样本（I和K）。测量显示，接受ICB治疗的NSCLC和EC患者的NAM/MNAM比率在治疗后也有类似变化，进一步支持NAM/MNAM比率作为ICB治疗反应指标的潜力。

（A）烟酰胺代谢的示意图。NAM可被NNMT催化或通过NAMPT进入NAD⁺补救途径，强调了两种酶在NAM代谢中的关键角色。（B）ACRG队列中NAMPT和NNMT高/低表达组的生存曲线。NAMPT和NNMT的中位表达量用作分界点。队列分析显示，NAMPT高表达组与更好的生存率相关，而NNMT高表达组与较差的生存率相关，进一步证明了这两种酶在GC预后中的相反作用。（C）统一流形近似和投影（UMAP）展示整合的101,676个细胞，按细胞类型标记。展示了GC样本中不同细胞类型的分布，揭示了巨噬细胞和成纤维细胞在肿瘤免疫微环境（TME）中的重要地位。（D）不同ICB反应中的细胞类型比例分布。蓝色方框中为成纤维细胞，橙色方框中为巨噬细胞。成纤维细胞在无反应患者（SD/PD）更丰富，而巨噬细胞在响应患者（PR）中更丰富。（E、F）表达NAMPT（E）或NNMT（F）的细胞比例和各细胞类型中阳性细胞的标准化表达水平（左），及按ICB反应分组的样本中的表达水平（右）。单细胞RNA测序显示，NAMPT在巨噬细胞中的表达高于其他细胞类型，且在PD患者中显著降低。NNMT主要在成纤维细胞中表达，在SD/PD患者中更高。（G和H） GC组织中免疫荧光（IF）染色的共定位。肿瘤相关成纤维细胞（CAF）标记物α-SMA和巨噬细胞标记物CD68显示为红色。NNMT和NAMPT显示为绿色。计算NNMT/α-SMA和NAMPT/CD68荧光强度的Pearson相关系数和Manders重叠系数。分析显示，NAMPT与巨噬细胞标记物CD68共定位，NNMT与成纤维细胞标记物α-SMA共定位，表明这两种酶在其各自细胞类型中的特异性表达。

（A）流式细胞术分析人外周血衍生巨噬细胞或NAMPT过表达巨噬细胞中M1（CD86）和M2（CD206）标记物，均用FK866处理（10 nM，48小时）。分析显示，NAMPT过表达促进了人外周血衍生巨噬细胞向M1表型极化，同时减少了M2表型，FK866可逆转这一效应。（B）RT-qPCR检测小鼠皮下肿瘤分离的CAF（m-CAFs）或过表达Nnmt的m-CAFs中肿瘤促进标记物（Vimentin、Vegfa、Il10和Tgfb1）的表达。oxNC，阴性对照。分析显示，Nnmt过表达小鼠CAF中肿瘤促进标记物的表达增加，NNMT抑制剂（NNMTi）可逆转这一效应。（C、D）细胞共培养系统示意图（上）。共培养48小时后，下腔室细胞的NAMPT表达（C）或NNMT表达（D）通过Western Blot检测。实验表明，巨噬细胞能显著抑制成纤维细胞中NNMT的表达，而成纤维细胞对巨噬细胞中NAMPT表达无显著影响，巨噬细胞在代谢对抗中起主导作用。（E）IF图像展示人巨噬细胞中EV标记物CD63和NAMPT的共定位。显示NAMPT与EV标记物CD63在巨噬细胞中的共定位，表明NAMPT通过EVs传递。（F）通过NTA分析BMDM衍生EVs和EV2的粒径分布。EVs，从BMDM上清液中超速离心获得的EVs。EV2，从EVs中通过碘克沙醇密度梯度离心获得的EV部分。分析显示，BMDM衍生EVs和EV2的粒径与传统外泌体相似。（G） CAFs与BMDMs共培养或用BMDMs培养上清（SN）处理。检测CAFs中的NAMPT和NNMT表达。EV-，离心后的上清液。实验显示，BMDM衍生EVs降低了CAFs中的NNMT表达，同时增加了NAMPT水平。（H）实验概览。将小鼠GC细胞系YTN-16皮下注射至C57BL/6小鼠。使用氯膦酸脂质体（Clo）消除巨噬细胞。肿瘤植入19天后，注射BMDMs或BMDM衍生EVs。动物实验显示，注射BMDMs或其衍生EVs显著抑制了GC小鼠模型中的肿瘤生长，且NAMPT过表达BMDMs或EVs组中血浆NAM/MNAM比率增加。（I）皮下肿瘤图像：显示了不同处理组的小鼠皮下肿瘤，实验组包括注射BMDMs或其衍生的外泌体（EVs）以及NAMPT过表达的BMDMs外泌体（oxNampt EVs）。结果显示，与对照组相比，注射BMDMs或BMDM衍生EVs显著抑制了肿瘤生长，NAMPT过表达的BMDM外泌体进一步增强了这种抑制效果。（J）肿瘤生长曲线：显示了不同处理组的小鼠皮下肿瘤的生长曲线。数据显示，注射BMDMs或其衍生的EVs显著抑制了肿瘤的生长，尤其是NAMPT过表达的BMDM外泌体组，进一步证明了NAMPT在抑制肿瘤生长中的关键作用。（K）通过ELISA测量注射不同处理组的小鼠血浆中的NAM/MNAM比率。数据显示，注射BMDMs或其衍生的EVs显著增加了小鼠血浆中的NAM/MNAM比率，表明这些处理有效调控了烟酰胺代谢。（L）通过流式细胞术检测不同处理组小鼠肿瘤浸润的IFN-g⁺GZMB⁺CD8⁺T细胞数量。结果显示，注射BMDMs或其衍生的EVs显著增加了肿瘤浸润的IFN-γ⁺GZMB⁺CD8⁺T细胞数量，尤其是NAMPT过表达的BMDM外泌体组，表明这些处理增强了CD8⁺T细胞的细胞毒性，进一步支持了NAMPT在调控免疫反应中的重要作用。综上所述，图3展示了巨噬细胞衍生的NAMPT外泌体在调控CAF中烟酰胺代谢、抑制肿瘤生长及增强免疫反应中的关键作用。这些结果为通过操纵烟酰胺代谢来改善胃癌治疗提供了新的策略和靶点。

（A、B）人胃癌组织的四色IF图像（A）和NNMT或NAMPT荧光强度与CD8的Pearson相关性（B）。CD8密度与NAMPT、CD68表达呈正相关，与NNMT、α-SMA表达呈负相关。（C、D）将人GC来源的CAFs（h-CAFs）单独或与人外周血来源的巨噬细胞（h-M4）按不同比例（1 : 3或3 : 1）种植于共培养孔的上室。下室培养人外周血来源T细胞48 h，收集细胞用于流式细胞术。检测细胞毒性（GZMB, IFN-γ）和耗竭标志物（PD-1, TIM-3）的表达（C）收集T细胞上清液进行NAM/MNAM比值测定（D）。在更大比例的巨噬细胞或更高水平的NAMPT的作用下，T细胞向活性表型转移，减弱了CAFs的抑制作用。此外，T细胞上清液的NAM/MNAM比值也升高。（E）用梯度浓度的巨噬细胞来源的EVs处理h-CAFs，并与人外周血来源的CD8⁺T细胞共培养24 h。流式细胞术检测GZMB和IFN-γ。处理成纤维细胞与梯度浓度的巨噬细胞来源的EVs后，再与CD8⁺T细胞共培养，发现成纤维细胞显著降低CD8⁺T细胞的细胞毒性，但随着EVs浓度增加，CD8⁺T细胞活性恢复。（F、G）与h-CAFs共培养或MNAM （5 mM, 24 h）处理后，流式细胞术检测IFN-γ和TNF-α，统计图见（G）。NNMT主要在肿瘤微环境中的成纤维细胞中表达，其表达与T细胞耗竭评分正相关，与效应CD8⁺T细胞不相关，外源MNAM处理或成纤维细胞共培养削弱CD8⁺T细胞的细胞毒性（减少IFN-γ和TNF-α），这种效应主要依赖于NNMT的表达或活性。（H）人类 CD8⁺T 细胞在不同浓度的 MNAM（5 mM）和 NAM（1 mM、5 mM、25 mM和50 mM）处理下的功能变化，处理时间为 24 小时。通过流式细胞术检测IFN-γ和 TNF-α的表达。NAM和MNAM的添加以剂量依赖的方式改变T细胞功能，表明巨噬细胞和成纤维细胞通过NAM代谢相互作用动态调控CD8⁺T细胞功能。综上所述，图4展示了烟酰胺代谢在巨噬细胞和成纤维细胞之间的交流，及其对CD8⁺T细胞功能的调控作用。这些结果为理解TME中细胞间的代谢互动及其对免疫反应的影响提供了新的见解，也为胃癌的免疫治疗提供了新的策略和靶点。

（A）在ACRG队列中，高表达和低表达NNMT组之间的11条致癌途径分数的差异分析。分析结果显示，NOTCH、WNT和HIPPO通路在NNMT高表达组中显著上调。（B）NOTCH、HIPPO、WNT通路分子与NNMT表达相关性的直方图分析。NOTCH途径分子与NNMT表达的相关性最高，进一步支持了NOTCH信号通路在NNMT调控中的重要作用。（C）在人成纤维细胞株HSF中过表达RBP-J或RBP-J抑制剂RIN1 （10 mM, 24 h）处理后，采用蛋白质印迹法检测NNMT和NOTCH信号通路靶基因（HES1和HEY1）的表达。RBP-J过表达显著上调NNMT和HES1、HEY1的表达。RBP-J抑制剂RIN1显著下调这些基因的表达，说明RBP-J通过调控NOTCH信号靶基因来调控NNMT的表达。（D）RBP-J在NNMT启动子区域的结合位点示意图。TSS，转录起始位点。在NNMT启动子区域（转录起始位点上游2,000 bp）识别出五个候选RBP-J结合位点。（F）染色质免疫沉淀（ChIP）检测RBP-J在NNMT启动子周围的富集。利用预测位点特异性引物对免疫沉淀DNA进行RT- qPCR分析。以抗组蛋白H3（Anti-histone H3）抗体作为阳性对照，以抗IgG（anti-IgG）抗体作为阴性对照。在两个位点（-1,471至-1,462 bp和-300至-291 bp）处，RBP-J的富集显著增加，表明RBP-J直接结合这些位点并调控NNMT的转录。（G）用BMDM衍生的EVs 或Selisistat （10 mM，24 h）处理小鼠CAFs，蛋白质印迹法检测NNMT、NICD、RBP-J和HEY1的蛋白水平。NAMPT-含有的EV抑制NOTCH信号通路（RBP-J、HEY1、 HES1）和NNMT的表达。SIRT1抑制剂Selisistat逆转了NNMT水平的下降，提示EVs可能通过SIRT1发挥作用。EVs降低了NAD+水平和SIRT1活性，增加CAFs中的NAM/MNAM比率。（H和I）BMDM衍生的EVs作用于m-CAFs后，NICD的乙酰化和泛素化的变化。EVs增加了NICD的泛素化水平，促进了其蛋白质降解，说明EVs通过SIRT1介导的NICD去乙酰化和泛素化降解抑制NNMT表达。EVs通过SIRT1依赖的去乙酰化机制降低NICD蛋白的稳定性，进而抑制NNMT的表达。（J）小鼠CAFs转染FLAG标记的NICD质粒（WT，野生型；14KR，突变赖氨酸[K]到精氨酸[R]），并用BMDM衍生的devsor Selisistat处理。在CAF细胞中，NICD去乙酰化突变体（阻止乙酰化的突变）在EVs处理下显示出NNMT表达的耐受性。突变体的表现验证了EVs通过SIRT1依赖的NICD去乙酰化机制调控NNMT表达。（K）用BMDM来源的EVs或Selisistat处理小鼠CAFs，然后与CD8⁺T细胞共培养24 h，流式细胞术检测IFN-γ和TNF-α。EVs减少NICD蛋白的核水平，最终影响了CD8⁺T细胞的细胞毒性。图5的各部分通过一系列实验展示了RBP-J作为NOTCH信号途径的关键转录因子，能够直接激活NNMT转录。同时，NAMPT含量的EVs通过SIRT1依赖的NICD去乙酰化和泛素化降解机制，抑制NNMT的表达，进而增强CD8⁺T细胞的抗肿瘤活性。这些发现为理解癌症微环境中代谢和免疫相互作用提供了新的视角，并为开发新的抗癌治疗策略提供了潜在的靶点。

（A）以抗PD-1为基础的YTN-16皮下肿瘤小鼠模型治疗流程图小鼠注射BMDMs或BMDMs衍生的EVs联合抗 PD-1和化疗。旨在研究BMDM或其来源的EVs对肿瘤生长和免疫反应的影响。（B、C）皮下肿瘤图像（B）和生长曲线（C）。siNampt EVs，从NAMPT敲低的BMDMs中分离的EVs。抗PD-1单药治疗对皮下肿瘤的效果有限。自体注射BMDM衍生的EV后，肿瘤生长受到抑制。（D、E）采用流式细胞术检测皮下肿瘤中IFN-γ⁺GZMB⁺CD8⁺T细胞的浸润情况。统计图表见（E）。注射BMDMs或其来源的EVs显著增加了肿瘤中活跃的CD8⁺T细胞比例，表明这些处理能够增强肿瘤免疫反应。处理组（特别是oxNampt EVs组）中CD8⁺T细胞比例显著增加，进一步支持了BMDMs或其来源的EVs对增强免疫反应的作用。（F）皮下肿瘤CD8免疫组化图像。oxNampt EVs处理组的肿瘤中显示出更多的CD8⁺T细胞浸润，说明这种处理能够有效吸引和激活CD8⁺T细胞。（G）显示NNMT和α-SMA表达和共定位的IF代表性图像。处理组（尤其是oxNampt EVs组）的NNMT水平显著降低，表明BMDM来源的EVs能够下调NNMT表达，从而影响肿瘤的代谢环境。（H）采用ELISA法测定小鼠血浆中NAM/MNAM比值。注射BMDMs或其来源的EVs（特别是oxNampt EVs）显著提高了血浆中的NAM/MNAM比率，这与改善的免疫反应和肿瘤抑制效果相关。图6整体展示了通过注射BMDMs或其来源的EVs，特别是过表达NAMPT的EVs（oxNampt EVs），可以显著抑制小鼠胃癌模型中的肿瘤生长。这些处理不仅增加了肿瘤中活跃的CD8⁺T细胞的比例和浸润，还降低了NNMT的表达水平，并提高了血浆中的NAM/MNAM比率。结果表明，BMDMs和其来源的EVs通过调控肿瘤代谢环境和增强免疫反应，具有潜在的治疗效果，尤其是在增强抗PD-1疗法的效果方面。这为利用细胞外囊泡作为癌症治疗的新策略提供了重要的实验依据。

在此项研究中，作者通过转录组学分析和动态血浆样本分析，揭示了胃癌肿瘤微环境中的一种代谢“博弈”机制，特别是烟酰胺代谢在其中的双重预后意义。具体而言，巨噬细胞和成纤维细胞分别表达限速酶烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）和烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT），调节烟酰胺/1-甲基烟酰胺（NAM/MNAM）比例，从而影响CD8⁺T细胞的功能。研究结果表明，通过调控烟酰胺代谢途径，特别是利用细胞外囊泡，可以显著增强胃癌的免疫治疗效果，为未来的治疗策略提供了新的方向。

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