文献精读：装载工程一氧化氮释放纳米载体的多功能微针用于靶向和协同慢性伤口治疗

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慢性伤口给患者带来了巨大的身体和精神负担。纳米制剂由于其非侵入性和增强的生物膜穿透性，为慢性伤口愈合提供了一种很有前途的策略，但它们往往缺乏靶向能力或无法实现长期和协同效应。武汉大学药学院黎威教授（通讯作者）和武汉大学同仁医院（武汉市第三人民医院）阮琼芳助理研究员（通讯作者）团队课题组提出了一种装载工程一氧化氮（NO）释放纳米颗粒（RE@SA-Con A/SNONPs）的多功能微针（MNs），该MNs包裹一种抗菌剂罗氏菌素（Reuterin），并与刀豆球蛋白A（Con A）和NO分子固定，用于靶向和协同治疗慢性伤口。NPs可以直接穿过细菌生物膜，并有效地递送到伤口组织，通过细菌表面上多糖和Con A之间的特异性识别来靶向有害细菌，随后释放被封装的抗菌剂。从而达到有效的抗菌效果。此外，NPs在伤口组织中解离时持续产生NO，发挥强大的抗炎作用，有利于组织再生，进一步促进慢性伤口愈合。因此，本研究提供了一种装载工程化NPs的新型MN，旨在通过靶向和协同治疗加速慢性伤口愈合。

（a）RE@SA-Con A /SNO NPs合成过程示意图。通过钙离子（Ca²⁺）将SA-Con A和SA-SNO交联合成RE@SA-Con A/SNO NPs。（b）SA-Con A的FTIR光谱。在1421 cm⁻¹处存在一个C-N化学键，通常与N-H拉伸振动有关，表明醛修饰SA和Con A之间成功形成了C-N键。（c）RE@SA-Con A/SNO NPs的TEM图像。合成的RE@SA-Con A/SNO纳米颗粒呈球形。（d）SA-SNO的FTIR光谱。在1386 cm⁻¹处存在S-N键，该键通常与S-N弯曲振动有关，表明SA-SNO合成成功。（e）RE@SA-Con A/SNO NPs的动态光散射（DLS）。合成的RE@SA-Con A/SNO纳米颗粒直径为255.00 ± 0.33 nm。（f）RE@SA-Con A/SNO NPs的包封效率和载药效率。NPs包封效率为57.65% ±3.72%，载药效率为21.09% ± 1.33%。（g）RE@SA-Con A/SNO NPs的Zeta电位。由于Ca²⁺的引入，RE@SA-Con A/SNO NPs的zeta电位增加到−0.23 ± 0.08 mV，表明NPs分散均匀。（h、i）RE@SA-Con A/SNO NPs中RE（h）和NO（i）的体外累积释放率。虽然在最初的2 h内有爆发释放，但在NPs中持续释放Reuterin长达60 h。并且，NPs可以持续释放NO约12 h。

（a）为了更好地可视化，用异硫氰酸荧光素（FITC）标记NPs。RE@SA-Con A/SNO MNs的具有代表性的明场和荧光场显微镜图像。纳米颗粒以10×10的阵列排列在衬底层上，面积约为0.5 cm²。（b、c）RE@SA-Con A/ SNO MN横截面和RE@SA-Con A/ SNO MNs的具有代表性的场发射扫描电镜（FESEM），黄色箭头表示MNs中被封装的NPs。证实了RE@SA-ConA/SNO纳米颗粒均匀分布在MNs中，每个MN为圆锥形，高850 μm，底座直径400 μm，间距700 μm。（d）体外植入RE@SA-Con A/SNO MNs后猪皮肤具有代表性的亮场和荧光场显微镜图像。应用5 min后，NPs迅速溶解，促进纳米颗粒有效地进入皮肤。（e） RE@SA-Con A/SNO MNs应用后的猪皮肤组织切片图像。MNs具有足够的机械强度（2.14±0.35 N），并且在离体猪皮肤中成功穿透而未破裂。（f）可穿戴多功能MNs贴在人体足部或手部无皮肤穿刺的演示照片。蓝色虚线方块表示MNs的位置。每片MNs中纳米颗粒的负载量为63.75 ± 2.42 µg，刺入皮肤后纳米颗粒的递送效率达到86.35% ± 1.49%。此外，MNs体积小巧，便于穿戴于足部或手部，用于治疗应用。（g）具有代表性的FESEM图像显示RE@SA-Con A/SNO NPs靶向细菌。红色箭头表示NPs与细菌之间的靶向界面。（h）RE@SA-Con A/SNO-FITC NPs靶向细菌的代表性荧光场显微镜图像。与金黄色葡萄球菌共孵育12 h后，FITC标记的RE@SA-Con A/SNO NPs有效靶向并结合金黄色葡萄球菌，FESEM图像进一步验证了这一点。当将Con A替换为牛血清白蛋白（BSA）时，纳米颗粒失去了靶向有害细菌的能力。结果表明，RE@SA-Con A/SNO NPs的靶向能力来源于Con A与细菌表面甘露糖基和葡萄糖基残基的特异性相互作用。

（a）有或没有RE@SACon A/SNO MNs治疗金黄色葡萄球菌（S. aureus）的代表性FESEM显微图像。观察到MNs与S. aureus孵育后，细菌细胞膜明显收缩和损伤。（b、g）不同MNs孵育24 h后S. aureus生长的代表性LB琼脂板图片和不同处理后LB液体培养基中S. aureus的OD₆₀₀值。可以观察到明显达到有效抑制细菌生长的效果。（c、f）不同处理对S. aureus 24 h抑制圈的代表性图像和S. aureus抑制圈直径。黑色虚线方块表示MN的应用位置，红色虚线圆圈表示抑制圈。抑菌区实验进一步验证抑菌效果，与其他处理相比，RE@SACon A/SNO MNs治疗组的抑菌区直径最大，为16.57 ± 0.42 mm。（d、h）不同MNs孵育24 h后S. aureus的活/死检测和细菌死亡率分析，结果表明，经过RE@SA-Con A/SNO NPs处理后的S. aureus活力最低。（e、i）不同处理S. aureus的共聚焦激光扫描显微镜和不同处理后S. aureus生物膜清除率。绿色：活细菌。与抗菌结果一致，RE@SA-Con A/SNO MNs对S. aureus生物膜的清除效果最好，由于Reuterin和NO分子的协同抗菌作用，生物膜清除率高达78.13% ± 1.48%。

（a-c）流式细胞术分析不同处理后Raw264.7细胞的细胞内CD86荧光强度、不同组CD86的流式细胞术直方图和不同组CD86相对表达量。结果显示RE@SA-ConA/SNO MNs显著降低CD86表达（从12.49% ± 0.11%降至3.17% ± 0.15%），显示其抗炎作用。（d-g）实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测不同处理后RAW 264.7细胞中IL-6和TNF-α的表达水平和免疫荧光技术测定不同处理后RAW 264.7细胞中IL-6的表达水平。RE@SA-ConA/SNO MNs治疗后IL-6和TNF-α水平显著降低，进一步证明MNs具有良好的抗炎作用。

（a、b）不同MNs处理HUVEC细胞后的活/死染色和细胞活力分析。将不同组的MN片与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞孵育24 h，发现细胞仍保持较高的活力，未出现明显的死亡（存活率> 90%）。（c、d）不同组处理HUVECs迁移的代表性图像和迁移率。RE@SA-Con A/SNO MNs处理促进了细胞迁移，迁移率最高，为75.87% ± 3.24%，表明RE@SA-Con A/SNO MNs促进细胞迁移的能力更强。（e、f）不同组处理HUVECs成管的代表性图像和定量分析。RE@SA-Con A/SNO MN组在大部分区域显示出明显的管状形成，而在对照组和其他MN组中仅观察到少量短细胞连接。量化总管长得出RE@SACon A/SNO MNs组与其他组相比，总管长度显著增加，这表明RE@SACon A/SNO MNs有效促进了小管的形成和血管生成。

（a）体内实验流程图。为了评价RE@SACon A/SNO MNs促进创面愈合的抗菌和治疗作用，通过接种慢性创面中最常见的病原菌S. aureus，在小鼠背部建立全层皮肤创面模型。两天后，将小鼠随机分为六组，并进行不同处理：不给药（对照组）、RE MNs、RE@SA MNs、RE@SA-Con A MNs、水凝胶包封RE@SA-Con A/SNO NPs以及RE@SA-Con A/SNO MNs。（b）不同处理后第0、3、5、7、9天小鼠皮肤创面代表性照片。黑色虚线圈表示原始伤口面积（直径：1 cm）。（c）9 d内各组创面形态变化示意图。（d）9天内不同处理小鼠皮肤创面创面面积-时间曲线。分析显示，RE@SA-Con A/SNO MNs处理的创面恢复速度明显加快，第9天创面大小仅为1.25% ± 0.59%，而其他组创面大小分别为16.67% ± 1.21%、15.42% ± 1.02%、12.65% ± 0.90%、8.39% ± 0.80%和7.72% ± 0.63%。（e）9天内不同处理小鼠的体重变化。体重未发现明显变化，说明MNs具有良好的生物相容性。

（a、c、e）第9天不同处理后H&E染色、Masson染色和IL-6免疫组化染色的代表性亮场显微镜图像。（b）第9天各组表皮厚度定量分析。H&E染色显示，与其他处理组相比，RE@SA-Con A/SNO MNs处理的伤口在第9天的再生上皮组织明显更厚，最大可达66.23 ± 11.54 μm，这表明RE@SA-Con A/SNO MNs能有效促进再生上皮组织的形成。（d）第9天各组胶原体积分数（CVF）的定量分析。第9天RE@SA-Con A/SNO MNs处理的创面胶原沉积明显增加，CVF为56.27% ± 3.11%，显著高于其他组。（f）第9天各组IL-6阳性细胞的定量分析。RE@SA-Con A/SNO MNs减少了伤口部位的炎症，与其他组相比，IL-6水平显著降低，表明MN具有良好的抗炎性能。（g、h）第9天不同处理后CD31（红色）和DAPI（蓝色）染色后创面组织新生血管的免疫荧光图像和CD31阳性细胞的定量分析。免疫荧光染色显示RE@SA-Con A /SNO MNs组创面部位CD31表达显著增加，进一步证明RE@SA-Con A /SNO MNs在活体内的促进创面愈合的优越能力。

本文章设计了一种新型的多功能MNs，装载工程化一氧化氮释放纳米载体（RE@SA-Con A /SNO NPs），用于慢性伤口的靶向和协同治疗。以SA聚合物为载体，包裹抗菌剂Reuterin，用Con A和NO分子固定纳米载体。Con A配体允许NPs通过特异性识别细菌表面的多糖来靶向有害细菌，随后释放抗菌药物60 h，使NPs具有靶向能力，具有有效的抗菌效果。同时，NPs能够持续释放NO，具有抗炎活性，促进组织再生，从而进一步促进慢性伤口愈合。在小鼠金黄色葡萄球菌感染的慢性伤口中，NPs在MNs的帮助下，直接穿透细菌生物膜，并有效地递送到感染的伤口组织中，表现出优异的清除有害细菌和加速慢性伤口愈合的能力。

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