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公众号推出的每一篇科研技巧相关文章均由W&H Group的成员在实验过程中所遇所得。旨在分享传播与创伤修复相关的实验技巧，包括造模技巧、实验操作的步骤和技术、常见问题及解决方案等。
简介
等温滴定量热法（ITC）是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。从结果的拟合曲线中，可以得到热力学参数，如解离常数（Kd）、结合常数（Ka）、结合位点数（n）、摩尔结合焓（ΔH）、摩尔结合熵（ΔS）、吉布斯自由能（ΔG）等，推断二者的相互作用以疏水相互作用还是静电吸引以及氢键作用为主。
原理
ITC仪器包含参比池和样品池，其中参比池中加入稀释溶液作为对照，彼此通过绝热装置隔开。在恒温条件下，注射器中的药物溶液滴定到含有目的蛋白的样品池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比，反应一定时间，仪器测量样品池的热量变化并使其与参比池平衡，显示为一个吸热或放热的峰。放热反应触发恒温功率的负反馈，而吸热反应则触发恒温功率的正反馈来保持温度恒定。当样品池中的蛋白溶液被药物分子饱和时，热量信号逐渐减弱，最后只能观察到滴定的背景溶液热量。
步骤
1、样品准备：可按经验浓度范围进行准备，样品池一般为10 μM~10 mM，滴定针比样品池浓度一般高10-20倍，建议初始尝试200 μM滴20 μM。样品池300 μL，滴定针50 μL。ITC实验一般包含A to B 和 A to Buffer两次滴定，A需要双倍用量。
2、开机：将计算机电源开启，直到Windows操作系统启动完成。开启仪器电源（Nano ITC）。待计算机侦测到Nano ITC，启动操控软件Launch ITCRun。确认仪器与计算机连机即可（查看操作软件状态栏的实时监测数值是否在跳动）。
3、样品前处理：准备约50 mL的缓冲溶液（用来润洗样品池及注射器，或是实验结束时先用缓冲溶液清洗）。将样品（滴定物及被滴定物）及缓冲溶液置入脱气装置进行脱气。设定脱气温度（同操作温度）、真空度（400 mmHg以上）及脱气时间（10 min以上）。
4、硬件操作（样品装载）：
（1）样品池：上样针装载缓冲溶液（与样品相同的缓冲溶液）润洗样品池3-5次。移除样品池内缓冲溶液后，利用上样针取300 µL样品缓慢的注射至样品池内。
（2）参比池：以相同的方式用脱气的去离子水润洗参比池。移除去离子水后，利用上样针取300 µL脱气的去离子水并缓慢的注射至参比池内。再将参比盖插入参比池内。
（3）注射器：仔细地装载滴定物至注射针筒中，并确认无任何气泡残留；若有可能，可将小气泡（5-10 µL）固定在推杆前。将注射针筒以旋转的方式（依照注射针筒上的螺纹）装载在注射器上，将多余溢出的样品擦拭干净。再将组合好的注射器及注射针筒安装在Nano ITC上。
5、软件操作（参数设定）：
（1）设定搅拌速率（小体积的Nano ITC搅拌速率通常设定在300-350 rpm），并启动搅拌马达。
（2）在页面中，设定操作温度、注射器体积及滴定程序等参数。
（3）平衡模式选择，在页面右下角处可依实验需求设定实验开始前的平衡模式。
（4）点击Start按钮，开始滴定。滴定完仪器会自动结束。
6、仪器清洁：为了安全考虑，请确认仪器温度接近室温（20-30 °C）再进行以下清洗步骤。实验开始与结束都要进行仪器的清洗。从Nano ITC主机上移除含有注射针筒的注射器，并利用上样针将样品由样品池内取出。将清洁套件小心地插入样品池内进行样品池清洗。将清洁附件管路连接，一端连接至装有清洁剂或是去离子水的容器中，另一端连接至脱气真空泵。所有装置设置好后，即可真空泵抽气将干净的清洁剂或是去离子水流经样品池再回到废液收集瓶内。一般情况下，先以300 mL的清洁剂（3% SDS或其他市面上专用清洁剂，如：Micro 90，Contrad 70，Decon 90）清洗，再以800 mL干净的去离子水清洗。
7、数据处理：实验结束后，数据保存，并用Launch NanoAnalyze软件进行后续的数据矫正与曲线拟合，并可导出文本文件用Origin等作图软件进行绘图。
特点
（1）能够在单个实验中确定多个热力学结合参数（即化学计量、缔合常数和结合焓）；
（2）对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势；
（3）样品用量小，灵敏度高且精确度高；
（4）无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰；
（5）不破坏样品结构，量热实验完毕，还可以进行后续生化分析。
常见问题与建议
1. 滴定剂与被滴定溶液的选择？
具体谁是滴定剂，主要取决于样品浓度、溶解度、样品量、价格，以及是否有特别实验设计。一般的，小分子和蛋白的实验，小分子溶液作为滴定剂，蛋白作为被滴定溶液。
2. 滴定曲线出现异常峰的原因？
3. 滴定曲线中的峰回不到基线？
4. 注意事项：要获取高质量数据，实验要设计合理，样品浓度合适，进行准确的浓度测定。实验操作上，需彻底清洗样品池和滴定针，水滴水确认仪器状态与洁净度，设置合理的滴定参数，同时选取合适的空白对照。
应用示例
1. 过氧化氢酶（CAT）与砷（As）（III）/As（V）的相互作用
<CAT与As（III）/As（V）相互作用的ITC曲线>[1]
2. 在醋酸缓冲液中，多氧金属酸盐（POM）与锆金属有机框架（NU-1000）的相互作用分析
<在不同浓度的醋酸缓冲液中，POM与NU-1000的热图和结合曲线>[2]
3. 表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）与甲壳素纳米晶体（ChNC）相互作用
采用ITC技术，研究了ChNC与表面活性剂之间的相互作用。在图（a）中，绝热室的示意图由含有ChNC的样品池和含有pH=3的去离子水的参比池组成。将pH=3的表面活性剂逐渐滴定到样品池中，记录每次注射产生的热变化并绘制在热图中。图（b）显示了100 mM SDS在pH=3时滴定到0.3 wt% ChNC和DI水中的原始热图。如图（c）所示，这些热峰被积分得到每摩尔表面活性剂的总焓变（ΔH）作为表面活性剂浓度的函数。将表面活性剂滴入去离子水得到的曲线为图（c）中黑色部分所示的稀释热曲线。修正后的每摩尔表面活性剂焓变化（ΔH），仅反映ChNC与表面活性剂之间的相互作用，通过从滴定曲线得出的焓变化中扣除表面活性剂稀释相关的焓变化来计算，如图（d）所示。图（c）中，100 mM SDS在水中的稀释最初表现为注射初期的吸热反应。这个吸热过程在焓变开始下降之前达到最大值，随着SDS浓度的增加而不断减小。临界胶束浓度（CMC）为曲线的拐点，在pH=3的情况下确定为6.6 mM，在pH=3（6.6 mM）时，注射器中的SDS浓度（100 mM）高于SDS的CMC，因此滴定剂呈胶束形式。在滴定到含有去离子水的样品池后，胶束开始解离，导致吸热变化。然而，当样品池内SDS浓度超过CMC时，仅由于胶束稀释而发生热变化。如图（c）所示，将100 mM的SDS滴入ChNC悬浮液中，SDS浓度最低时出现了一个明显的放热峰，并迅速转变为吸热变化。这种模式可能SDS与壳聚糖/疏水改性壳聚糖之间的相互作用，具有明显的放热和吸热转变。
4. 硫酸葡聚糖（DS）与乳清分离蛋白（WPI）的热力学
通过ITC测量了WPI/DS混合物形成过程中的热量变化，计算得到了热力学参数，包括结合亲和化学计量（n）、结合亲和常数（Ka）、焓变（ΔH）、熵变（TΔS），T为开尔文温度（298.15 K）和Gibbs-free能量变化（ΔG），使用公式ΔG = ΔH−TΔS计算。图（a）和图（b）所示的典型热图（热速率与时间曲线）对应于柠檬酸缓冲溶液中25 °C的滴定，其中pH=6.5时使用WPI（2000 μM）和DS（20 μM），pH=5.5时使用WPI（2000 μM）和DS（5 μM）。图（a-b）所示的结合等温线是使用“一个独立结合位点”模型从热图中得出的。随着DS注入的增加，释放的热量减少，可能是因为WPI上与DS结合的正电荷减少。在滴定过程中，pH=6.5（图a）（−8.822 ± 0.18 kJ/mol）、pH=5.5（图4b）（−13.02 ± 0.56 kJ/mol）时的ΔH均为负值。负ΔH通常表明静电相互作用和放热过程。在本研究中，WPI与DS之间的相互作用是静电相互作用。在pH=5.5时，根据相图结果，WPI和DS形成了最易溶的配合物，并表现出较强的静电相互作用。然而，在pH=6.5时，WPI和DS都带负电荷；WPI上只有带正电的贴片能与DS发生静电相互作用，ΔH绝对值最小。在滴定过程中，pH=6.5和pH=5.5的TΔS为正。正熵变归因于反离子和水分子的释放。基于上述分析，推测在pH=5.5和pH=6时，WPI与DS的相互作用主要是自发放热反应，由焓和熵共同驱动，静电相互作用为主导。
<在pH=6.5和5.5时，DS与WPI在柠檬酸缓冲溶液中ITC曲线>[4]
5. β-环糊精（β-CD）与乙酸甲酯（LMA）和乙酸萜品酯（TA）的包合行为
在本研究中，采用ITC比较了β-CD与LMA和TA的包合行为。β-CD与TA的平衡结合常数（9881 M−1）高于LMA的平衡结合常数（2754 M−1），表明β-CD与TA形成配合物的能力更强。此外，对酯芳香化合物与β-CD络合过程中的吉布斯能量变化值（ΔG）的评估显示，β-CD与酯芳香化合物的络合作用为-19725.2和-23425.7 kJ/mol，这表明酯芳香化合物与β-CD的络合作用是自发的。ΔG值越低，对应系统内部的自发性程度越高。值得注意的是，TA与β-CD络合的ΔG值更负，表明其热力学性质较好，稳定性较高。综上所述，β-CD和TA之间的相互作用是自发发生的，从而显著提高了溶解度、络合效率和整体稳定性。小而负的焓变（ΔH）值表明是一个弱放热过程。ΔH与熵变（ΔS）的相反符号相结合，证实了疏水和静电相互作用都有助于结合过程。一般来说，ΔS可归因于两种疏水力的影响。第一个组分来自客体分子周围的疏水力，包括包裹在β-CD腔中的分子和包合体系中少量的自由分子。疏水力的第二个组成部分来自于酯芳香化合物/β-CD包合物形成过程中高能水分子的释放。这包括β-CD疏水腔内的水分子，β-CD外亲水表面的水分子，以及芳香族分子疏水结构周围的水分子。这些基团具有很强的疏水性，从而增强了包合过程中的熵驱动。
<酯类芳香化合物滴定β-CD的ITC曲线>[5]
总结
ITC是基于复合物形成时所放出或吸收的热量的精确测定，是能够同时测量结合参数的先进技术。其应用范围广，主要应用在如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-小分子相互作用、酶-抑制剂相互作用、药物-DNA/RNA相互作用、蛋白质-核酸相互作用和核酸-小分子相互作用等。
相关参考文献
[1] Wang T., Jing M., Hu S., et al. Differential response of catalase to As (III) and As (V): Potential molecular mechanism under valence effect[J]. Science of The Total Environment, 2024, 951, 175562.
[2] Fahy K. M., Sha F., Reischauer S., et al. Role of Metal–Organic Framework Topology on Thermodynamics of Polyoxometalate Encapsulation[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(23): 30296-30305.
[3] Sarker P., Su X., Rojas, O. J. Khan, S. A. Colloidal interactions between nanochitin and surfactants: Connecting micro- and macroscopic properties by isothermal titration calorimetry and rheology[J]. Carbohydrate Polymers, 2024, 341, 122341.
[4] Zheng L., Chang Q., Chen X., et al. Phase behavior and interaction of strong polyelectrolyte dextran sulfate and whey protein isolation: Effects of pH, protein/polysaccharide ratio, and salt addition[J]. Food Chemistry, 2025, 464, 141815.
[5] Xiao, Z., Yu, P., Sun, P., et al. Inclusion complexes of β-cyclodextrin with isomeric ester aroma compounds: Preparation, characterization, mechanism study, and controlled release[J]. Carbohydrate Polymers, 2024, 333, 121977.
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