忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）是我国传统的药用植物，其花、茎和叶分别称为金银花、忍冬藤和忍冬叶。目前，《中华人民共和国药典》仅收载了金银花和忍冬藤，而忍冬叶被视为忍冬的非药用部位，尚未得到充分利用。但忍冬叶有过药用历史，现代研究发现，忍冬藤、忍冬叶和金银花具有相似的化学成分和药理作用，且忍冬幼叶总酚酸含量显著高于花的各发育期。超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UPLC-QEOrbitrap-MS）具有极高的分辨率，近年来越来越多的应用在中药化学成分定性上，已成为复杂药物体系成分分析的重要方法。北京中医药大学中药学院的刘舒鹏、黄厚钰、李卫东*等人通过UPLC-QE-Orbitrap-MS技术分析金银花与忍冬叶化学成分差异，以秀丽隐杆线虫为实验生物，探究两者抗衰老活性差异，通过网络药理学预测两者抗衰老的潜在活性成分及机制，旨在为金银花与忍冬叶资源开发利用提供科学依据，也为药用植物非药用部位研究与应用提供新视角。
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如图1所示，正离子和负离子模式下信号强度差异不大，但负离子模式下基线更平稳，噪声更小，故选用负离子模式用于化合物鉴定。图1表明，不同部位的离子流峰保留时间和数量基本一致，但大部分离子流峰的信号强度差异明显。从EELF与EELL中共鉴定出122 种化合物，有机酸类化合物35 种、黄酮类化合物27 种、环烯醚萜类化合物37 种、其他化合物23 种。金银花和忍冬叶化学成分组成相似，共有73 种成分均在两者中检出。而苹果酸、咖啡酰奎宁酸葡萄糖苷、岛尿苷B、5-去氧野芝麻醇、黄芩苷、新芒果苷、七叶苷、软脂酸、莫诺苷等仅存在于EELL中，未在EELF中检出；马钱子苷、木犀草素-5-O-β-吡喃二葡萄糖苷、二氢-裂环氧化马钱苷、二氢脱氢二硝基醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、林生续断苷II、栗色鼠尾草酰奎宁酸-咖啡酰奎宁酸或异构体、咖啡酸、赤藓糖苷、玫瑰糖苷等仅存在于EELF中，未在EELL中检出。部分鉴定的化合物具体信息见表1。![]()
EELF和EELL所含化学成分种类大致相同，最主要的成分均含有机酸类、黄酮类以及环烯醚萜（图2A）。图2B表明两者化学成分含量分布基本一致，但EELL中总黄酮、异绿原酸C和木犀草苷含量极显著或显著高于EELF（P＜0.05、P＜0.01），异绿原酸A含量则EELF极显著高于EELL（P＜0.01），绿原酸、总酚酸含量两者间无显著差异（P＞0.05）。
如图3A所示，与对照组相比，中质量浓度（500 μg/mL）和高质量浓度（800 μg/mL）EELL处理均能显著提高线虫的抗氧化应激效应能力，其中中质量浓度组培养8 h以后存活率高于其他实验组，而低质量浓度组的抗氧化应激能力无明显作用。
EELF和EELL对N2线虫的抵抗氧化应激能力显著高于对照组，同时，EELL干预效果优于EELF，EELL延长了氧化应激状况下N2线虫生存时间，在培养后期存活率明显提高；与对照组相比，EELF与EELL组N2线虫生存曲线右移，表明这两组线虫抵御氧化应激的能力普遍提高（图3B）。与对照组相比，EELF和EELL都显著提高N2线虫抵抗热应激的能力，而EELL与阳性对照组之间无显著差异（图3C）。
EELF和EELL均可以显著延长线虫的平均寿命，最长寿命均高于空白对照组（图4）。EELL可以显著延长线虫的寿命（P＜0.05），达到32.79%，EELF显著延长了线虫的寿命（P＜0.05），达到了28.69%，EELL与EELF效果相当，表明EELF和EELL对线虫的健康和寿命延长都具有积极作用。
EELF与EELL对线虫运动能力的影响如图5所示。随着机体的衰老，线虫的运动能力逐渐下降，在前5 d中，EELF和EELL对线虫的运动状态影响并不显著；在培养到10 d之后，与对照组相比，EELF与EELL均能提高线虫的蠕动状态，在培养到20 d时，对照组中的线虫运动状态无A级，表明EELL可提高线虫的运动能力，进一步说明EELL不仅能够延长线虫寿命，还能够提高秀丽隐杆线虫运动能力。
EELF与EELL组总产卵量相较对照组显著增加（P＜0.05），EELL组相对于EELF组总产卵量显著增加（P＜0.05）（图6A）。说明EELF与EELL能够提高N2线虫的生殖能力，且EELL干预效果优于EELF。从图6B看出，相比于对照组，EELL组N2线虫的生殖期高峰期延迟了2 d，这可能与N2线虫的性器官成熟期和排卵期的变化有关，性器官的成熟和衰老代表生育能力的变化和衰老密切相关，表明EELL对N2线虫延缓衰老的功能更为明显。
活性氧水平是衡量机体氧化程度的重要指标之一，活性氧的积累会对机体造成不同程度的损伤。对照组相对荧光强度明显强于其余两组，表明EELF与EELL线虫细胞内活性氧相对含量较对照组显著降低，但两者间无明显差异（P＞0.05）（图7）。![]()
线虫随着年龄的增加，脂褐素在体内堆积量也会增加，脂褐素积累水平可以反映线虫的衰老状况。EELF与EELL组荧光强度显著低于对照组（P＜0.05）（图8A）。在用EELL培养10 d后，EELL组线虫体内的相对荧光强度比对照组降低51.59%，且优于EELF组（图8B），表明EELL能够更有效地延缓衰老。
根据解析出的122 个化合物，通过PubChem数据库查询已鉴定化学成分的结构，导入SwissADME数据库检索，以胃肠吸收为“高”及5 种类药性预测中“Yes≥2”等条件筛选出具有较好口服生物利用度和类药性的潜在活性成分，并通过文献与《中华人民共和国药典》比较，获得16 个潜在活性成分（表2）。
通过SwissTargetPrediction数据库获得EELF和EELL共同活性成分靶点268 个。利用GeneCard和OMIM数据库检索后，去重得到807 个疾病靶点。将成分靶点与疾病靶点取交集，得出EELF和EELL抗衰老的59 个潜在作用靶点。通过STRING数据库，将59 个潜在作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件构建PPI网络。得到17 个可能的核心靶点，其中排名靠前的有：信号转导和转录激活因子3（sSTAT3）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）1、表皮生长因子受体（EGFR）、类固醇受体辅激活因子（Src）、胱天蛋白酶（CASP）3、肿瘤坏死因子（TNF）。为进一步解析EELF和EELL抗衰老的机制，将17 个核心靶点导入DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析。分析显示，BP条目382 个，主要涉及蛋白质磷酸化、信号转导、RNA聚合酶II启动子的转录、凋亡过程、基因表达、细胞增殖等；CC条目55 个，主要涉及细胞质、细胞核、核浆、等离子体膜、细胞膜等；MF条目87 个，主要涉及蛋白结合、ATP结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、同源蛋白质结合、蛋白AKT活性、蛋白激酶活性等。对前10 个条目绘图，如图9所示。KEGG富集分析得到142 条通路，主要涉及癌症通路、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT信号通路、血脂与动脉粥样硬化、人类巨细胞病毒感染、人乳头瘤病毒感染、癌症蛋白聚糖类等。这些结果表明，EELF和EELL通过调控癌症、细胞周期相关途径发挥抗衰老作用。
将EELF和EELL潜在活性成分、核心靶点基因、通路导入Cytoscape 3.7.2软件，构建抗衰老的“成分-靶点-通路-疾病”网络图。图10中共有35 个节点、161 条边，说明EELF和EELL抗衰老作用是多成分、多靶点、多通路共同作用的结果。利用Network Analyaer工具计算拓扑参数，将度值排名前5的作为核心潜在活性成分，分别为槲皮素、金圣草黄素、芹菜素、小麦黄素、木犀草素。从“成分-靶点-通路-疾病”网络图还可得出与核心靶点相互作用的成分与通路，如槲皮素通过作用糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、类固醇受体辅激活因子（SRC）、表皮生长因子受体（eEGFR）、周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）1等靶点，激活PI3K/AKT信号通路、癌症通路等信号通路，发挥抗衰老作用。
金银花为大宗药食同源药材，是连花清瘟胶囊、双黄连、银翘片等中成药组成的君药，在抗击人类新冠病毒疫情中发挥了重要作用，金银花也应用于王老吉、加多宝等食品产品，沐浴露、洗面奶等日化用品也常见金银花。近年来，金银花愈来愈有供不应求之势，其资源量受限，特别是在新冠病毒疫情环境下更为明显，而忍冬叶资源量大，但常被浪费。本研究采用UPLC-QEOrbitrap-MS技术对金银花与忍冬叶的化学成分进行比较分析，共鉴定出122 个成分，主要为有机酸类、黄酮类以及环烯醚萜类成分，为金银花与忍冬叶的开发利用提供了有效成分基础和理论依据。金银花与忍冬叶两者化学成分相似，均能显著提高线虫寿命，降低活性氧与脂褐素水平。二者主要在一些异构体和部分含量较低的成分上具有一定的差异。如苹果酸、咖啡酰奎宁酸葡萄糖苷、新芒果苷等仅存在于EELL中；马钱子苷、二氢-裂环氧化马钱苷、林生续断苷II等仅存在于EELF中。但是常见的成分如绿原酸、异绿原酸（A/B/C）、木犀草苷、芦丁、断马钱子酸、断氧化马钱子苷等均在二者中大量存在。基于UPLC-QE-Orbitrap-MS分析结果，利用网络药理学方法分析EELF和EELL抗衰老的靶点和信号通路。结果显示，抗衰老的核心靶点可能有STAT3、AKT1、EGFR、SRC、CASP3、TNF等，涉及的信号通路有癌症通路、PI3K/AKT、人类巨细胞病毒感染、丙型肝炎等。其中AKT1与多个活性成分及信号通路相关，参与蛋白质磷酸化、信号转导、癌症通路、PI3K/AKT信号通路、动脉粥样硬化等。研究表明，抑制AKT1可以延长小鼠的寿命，激活则缩短寿命。SRC的抑制可以促进组织中的细胞凋亡而不是衰老，以此阻止衰老细胞在体内的积累，以改善健康状况。白细胞介素（interleukin，IL）-6是一种多功能细胞因子，对免疫反应、细胞存活、细胞凋亡和增殖很重要，IL-6的表达和分泌可促进STAT3信号通路的激活，从而抑制肿瘤细胞的衰老。EGFR与阿尔茨海默病和衰老等神经代谢紊乱有关，EGFR的激活可以保护神经元免受毒性损伤。CASP3是细胞凋亡途径中最为关键的酶类之一，与癌症的发生、衰老、心血管疾病的发生等有着重要联系。研究表明，CASP3的表达和活性均随着年龄的增长而增加。TNF在认知和衰老过程中发挥作用，在3 个月时，TNF敲除小鼠表现出更差的记忆力。综上所述，STAT3、AKT1、EGFR、SRC、CASP3、TNF参与了衰老进程，涉及细胞增殖、细胞凋亡、神经代谢紊乱等。通过SwissADME数据库与“成分-靶点-通路-疾病”网络，筛选出16 个潜在活性成分。包括槲皮素、金圣草黄素、芹菜素、小麦黄素、木犀草素等。槲皮素广泛存在于植物中，研究表明，槲皮素及其代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸以相反的方式控制神经干细胞的活力，槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸可以增强AKT磷酸化和细胞周期蛋白D1表达，提升神经干细胞活力，从而显著改善东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。金圣草黄素可以抑制STAT3信号传导，产生抗黑色素瘤作用。芹菜素可以通过对线粒体介导的细胞凋亡产生抑制作用，延迟D-半乳糖诱导的果蝇衰老。小麦黄素是存在于米糠中的一种黄酮，可以抑制弹性蛋白酶和酪氨酸酶延缓皮肤衰老。木犀草素通过抑制脑小胶质细胞从而抑制神经炎症并改善衰老小鼠的认知能力。
EELF和EELL具有相似的化学成分，两者可能通过槲皮素、金圣草黄素、芹菜素、小麦黄素、毛地黄黄酮等化学成分作用于STAT3、AKT1、EGFR、SRC、CASP3、TNF等核心靶点，发挥抗衰老作用。本研究结果表明，忍冬叶抗衰老作用不弱于金银花，通过多成分、多靶点、多通路共同发挥疗效，本研究可为金银花与忍冬叶药效物质基础、作用机制及其开发利用提供一定的科学依据。本文《基于超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱技术与网络药理学揭示金银花与忍冬叶化学成分差异及抗衰老机制》来源于《食品科学》2024年45卷第20期1-11页，作者：刘舒鹏，黄厚钰，王笑雪，郝巨辉，李卫东。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240510-070。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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