食品真实性以实现消费信任为目标，防止掺假与欺诈，保证食品的安全与可靠，是全球食品安全领域的新热点，是当前食品安全监管领域的重点、难点。随着科技的发展，肉制品真实性检测方法越来越多样化，基于核酸扩增技术的聚合酶链式反应（PCR）、实时荧光PCR等技术可以从样品中检测出痕量目标分子，具有灵敏特异等诸多优势，已经成为食品真实性研究的一个基本和必要的技术手段，并在检测领域中广泛应用。多酶恒温快速扩增（MIRA）技术是在重组酶聚合酶扩增（RPA）技术的基础上发展起来的一种多酶恒温核酸快速扩增方法。
为了提高肉制品真实性检测方法的可操作性，建立建全肉制品真实性检测的快检方法，成都市食品检验研究院的尚柯、张彪*、张敏等针对肉制品建立了牛、羊、猪、鸡、鸭专属性MIRA-LFD(多酶恒温快速扩增-封闭式侧向流层析)检测方法，以期为监管部门提供肉制品真实性现场快检技术手段。
01
引物探针设计结果
本方法选取被广泛应用于物种鉴别的线粒体基因细胞色素氧化酶b（Cyt b）基因、线粒体细胞色素c氧化酶I亚基（Cox I）和线粒体DNA 12S rRNA（12S）作为靶基团，在GenBank数据库中选择牛（GU249568.1）、猪（X56295）、羊（AF010406）、鸡（MT800504.1）、鸭（U59666.1）的基因序列进行引物和探针的设计（表4）。
在引物设计时，选择碱基排布随机性高、GC相对含量在30%～70%之间的引物序列，并且在下游引物的5’端标记biotin修饰基团；对于MIRA法的探针序列，应避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基，长度一般在46～52 nt，在5’端修饰一个FAM标记，在距5’端约30 nt序列位置上标记一个dSpacer（四氢呋喃）作为nfo（核酸内切酶）的识别位点，另外THF距离3’末端约15 nt，并且3’末端标记一个C3 spacer修饰基团。根据物种序列比对结果，结合MIRA引物探针设计原则，对牛、羊、猪、鸡、鸭的引物和探针序列进行高级结构分析比对，以确保其高度的特异性，防止出现二聚体、茎环及发卡等影响检测效率的结构，共设计22 条正向引物、23 条反向引物、9 条探针。
02
引物探针筛选结果
2.1 阳性对照筛选研究
根据74 对引物与试剂盒配套阳性对照结果（以鸭源性检测为例，见图2），70 对引物组合阳性对照均出现条带（除N1～N4），但其中D3组合和D6组合空白对照结果出现明显引物二聚体，因此筛选其他引物组合与相应的探针进行后续实验。
2.2 空白对照筛选研究
2.3 阴性对照筛选研究
03
MIRA-LFD检测体系建立
3.1 反应体积筛选结果
3.2 反应温度筛选结果
根据图7结果显示，30、37、40 ℃样品动物源性成分检测结果T线均出现明显条带，但在37 ℃条件下实验结果最好。40 ℃羊源性、猪源性、鸡源性样品空白对照T线均出现明显条带，说明出现了非特异性扩增情况。50 ℃条件下，T线条带均不明显，推测50 ℃影响了酶的活性。因此选择37 ℃作为MIRA-LFD反应的温度。
3.3 反应时间筛选结果
根据图8结果显示，随着反应时间的延长，MIRALFD检测体系中的非特异结合更易出现（图中空白对照结果）。因此选择5 min作为MIRA-LFD检测体系的反应时间。
3.4 检出限研究及方法建立
04
方法学考察结果
4.1 快提试剂盒与传统试剂盒比对
4.2 灵敏度考察结果
灵敏度考察结果见图12与表5。结果显示，本实验建立的牛、猪、羊、鸡、鸭方法的灵敏度分别为90%、100%、100%、100%、80%，平均灵敏度为94%。
4.3 特异性考察结果
特异性考察结果见图13与表6。结果显示，本实验建立的牛、猪、羊、鸡、鸭方法的特异性均达到1%。
4.4 假阳性率、假阴性率考察结果
假阳性率、假阴性率考察结果见表7。以表3实时荧光PCR结果作为对比依据，结果显示，本实验建立的牛源性检测方法假阳性率为0%，假阴性率为2.56%；猪源性检测方法假阳性率为7.69%，假阴性率为5.13%；羊源性检测方法假阳性率为4.76%，假阴性率为0%；鸡源性检测方法假阳性率为0%，假阴性率为10%；鸭源性检测方法假阳性率为5%，假阴性率为0%；方法的平均假阳性率为3.49%，假阴性率为3.54%。
结论
作者简介
张彪，硕士，高级工程师，成都市食品检验研究院生物检测研究所骨干。主要从事食品真实性检测、新方法研究、新产品开发工作。主持参与过多项国家科技支撑计划、总局方法开发/省部级项目、市级科技计划课题研究，科技成果共十余项；国内外期刊发表文章3 篇，申请发明专利10余项；参与发布国家食品补充检验方法2 项。
尚柯，硕士，高级工程师，成都市食品检验研究院生物检测研究所副所长。主要从事食品真实性检测及新方法研究、新产品开发工作，任中国食品科学技术学会食品真实性与溯源分会第二届委员会委员， TICA成都市检验检测认证协会特聘专家。主持参加过多项国家科技支撑计划、总局方法开发/省部级项目、市级科技计划课题研究，科技成果共十余项；国内外期刊发表文章7 篇，申请发明专利10余项；主持发布国家食品补充检验方法1 项，参与发布国家食品补充检验方法2 项。
本文《基于多酶恒温快速扩增-侧向流层析联用技术的肉制品真实性研究》来源于《食品科学》2024年45卷第8期1-12页，作者：尚柯, 张彪, 张敏, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230829-214。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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